结直肠癌患者PCR初检KRAS G13D、复检Q61突变？

KRAS是结直肠癌（CRC）中最常见的突变癌基因之一，约40%的CRC病例存在KRAS突变。KRAS突变具有高度的多样性。研究表明，KRAS基因13号密码子（G13）突变的患者死亡风险更高，而12号密码子（G12）突变也与预后相关，但其对死亡风险的影响低于13号密码子突变。因此，明确具体的KRAS突变类型对于评估患者预后和制定个性化治疗方案至关重要。KRAS突变通常发生在单个外显子上，而同一组织中同时存在2号外显子（G12/G13）和3号外显子（Q61）的共突变尚未见报道。本研究报道了一例 72 岁男性CRC患者的KRAS基因两个外显子（2号和3号）共突变病例，该患者的腺癌位于距肛门 8 cm处。下一代测序（NGS）和扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）检测显示，该患者的KRAS基因两个外显子存在共突变——3号外显子Q61H突变，突变丰度为 21.09%；2号外显子G13D突变，突变丰度为 6.06%。同时还发现该患者的MET基因存在拷贝数增加（拷贝数：5.65）。本文分析了其临床病理特征，并进一步探讨了可能的机制。然而，由于KRAS基因两个外显子共突变的CRC患者极为罕见，因此亟需开展纳入更多患者临床数据的队列研究。

背 景

结直肠癌（CRC）是全球第二大常见确诊癌症，也是癌症相关死亡的第四大主要原因。据估计，每年有 120 万人被诊断为结直肠癌。预计到 2040 年，结直肠癌的疾病负担将增至320万新发病例和 160 万死亡病例，且大多数病例将出现在人类发展指数高或极高的国家。作为最常发生突变的癌基因，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）已受到广泛关注。KRAS是结直肠癌中常见的突变癌基因，约 40% 的结直肠癌病例存在KRAS突变。携带KRAS突变的结直肠癌患者预后较差。KRAS突变具有显著的异质性，存在多种不同的突变亚型，包括但不限于G12C、G12D和G12V。不同的突变类型可能以不同方式影响肿瘤生物学行为和治疗反应。KRAS 2号外显子突变（如p.G12D/V/C/A等或G13D等）占KRAS突变的大多数，而3号外显子（p.Q61L/R/H）和4号外显子（p.A146T/P/V）突变仅占结直肠癌病例的 1%–4%。不同类型的KRAS基因突变对患者预后有显著影响。研究表明，KRAS基因13号密码子（G13）突变的患者死亡风险更高。此外，KRAS基因12号密码子（G12）突变也与预后相关，但其对死亡风险的影响低于13号密码子突变。因此，明确具体的KRAS突变类型对于评估患者预后和制定个性化治疗方案至关重要。这些发现强调了精准分子特征分析的关键重要性，以及KRAS两个密码子的突变在辅助治疗背景下推动恶性肿瘤进展的核心作用。尽管在靶向KRAS驱动型癌症方面取得了突破，但共突变的分层仍是一大障碍。技术层面上，区分驱动突变（driver mutation）与乘客突变（passenger mutation）、检测低频变异以及解读复杂突变模式需要高灵敏度测序技术和先进的计算工具。临床层面上，KRAS与其他共存突变（如TP53、STK11或KEAP1）之间的功能相互作用导致肿瘤行为、治疗反应和耐药性存在差异。目前预测生物标志物、功能验证和临床注释方面的局限性进一步加剧了患者分层的复杂性。解决这些问题需要整合多组学方法、标准化报告以及前瞻性研究，以优化精准肿瘤学策略。本研究分析了结直肠癌患者中KRAS基因两个外显子共突变的临床病理特征，并进一步探讨了可能的机制。然而，由于KRAS基因两个外显子共突变的结直肠癌患者极为罕见，因此亟需开展纳入更多患者临床数据的队列研究。

研究方法

患者和样本

本研究从浙江大学医学院附属第一医院临床病理系统档案中调取了KRAS基因扩增阻滞突变系统（ARMS-PCR）的检测结果。截至 2025 年 1 月，在 11153 例结直肠癌病例中仅发现 1 例（1/11153，0.009%）存在KRAS基因两个外显子共突变的情况。随后收集了该患者的临床资料，包括血液检查、计算机断层扫描（CT）数据、结肠镜检查报告、临床病理检查数据等。病理分期参照《美国癌症联合委员会（AJCC）癌症分期手册第八版》进行判定。优先选用原发灶福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。样本的最低肿瘤细胞占比要求为 ≥30%（由病理学家通过苏木精-伊红染色切片评估）。低于该阈值的样本需进行显微切割处理。

KRAS的分子检测

采用下一代测序（NGS）检测panel，检测 10 个基因的常见突变：EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER2和MET。同时分析拷贝数变异（CNV）、融合突变以及单核苷酸变异/插入缺失（SNV/indels）。所有操作均按照说明书进行。此外，采用实时扩增阻滞突变系统（ARMS-PCR）验证KRAS突变。

免疫组化

从患者体内手术切除组织样本，随后进行固定、脱水、石蜡包埋和切片，以备后续分析。石蜡切片经苏木精-伊红（H&E）染色后，在显微镜下进行形态学评估。将 3 μm厚的石蜡包埋组织切片置于全自动免疫组化染色系统中进行处理。在每张切片的四角滴加自研液体外对照，以全程监控染色过程。同一实验结果由两名经验丰富的病理学家独立评估。

研究结果

在 11153 例接受KRAS突变筛查的结直肠癌（CRC）病例中，仅 1 例（1/11153，0.009%）存在KRAS基因两个外显子的共突变。该患者为 72 岁男性，主诉腹痛症状已持续 1 年余。全腹部计算机断层扫描（CT）显示，直肠上段及直肠乙状结肠交界处存在癌灶，同时伴肠系膜及腹膜后多发淋巴结转移（图1A）。内镜评估未发现肠穿孔迹象，距肛门 8 cm处可见一形态不规则的环周肿瘤，已完全阻塞肠腔（图1B），肠腔明显狭窄导致内镜无法通过。术中取 6 块活检标本进行病理评估，标本质地均较硬，易出血。结合 6 项免疫组化标记的组织病理学分析，最终确诊为距肛门 8 cm处的腺癌，免疫组化染色结果见图2。

▲图1 KRAS双外显子共突变CRC患者的CT和结肠镜检查结果

▲图2 石蜡包埋的CRC标本切片进行的H&E染色和免疫组化染色

下一代测序（NGS）和扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）检测显示，该患者存在KRAS基因两个外显子的共突变（图3）。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取的DNA分别进行了ARMS-PCR检测（图3A-B）和NGS分析（图3C）。鉴于该突变极为罕见，研究人员对FFPE标本进行了独立重切，并重复进行ARMS-PCR验证以确认结果（图3B为第二次重切标本的检测结果）。此外，由于ARMS-PCR无法区分Q61L/R/H的具体突变类型，也无法提供突变丰度信息，本研究中使用另一种新型检测方法NGS进行双重验证（图3C）。

▲图3 NGS和 ARMS-PCR 显示该患者的KRAS两个外显子同时发生突变

采用下一代测序（NGS）panel检测 10 个基因的常见突变：EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、HER2和MET，同时分析拷贝数变异（CNV）、融合突变以及单核苷酸变异/插入缺失（SNV/indels）。NGS结果（图3C）显示，KRAS 3号外显子的突变为Q61H，突变丰度为 21.09%；KRAS 2号外显子的突变为G13D，突变丰度为 6.06%。 

需要说明的是，两次ARMS-PCR检测显示出不同的优势突变类型：第一次检测中G13D为优势突变（图3A），第二次检测中Q61L/R/H为优势突变（图3B）。这种差异可能源于第二次重切标本中携带不同突变的肿瘤细胞占比发生了变化。此外，除KRAS 2号外显子（G13D突变）和3号外显子（Q61H突变）外，该患者还存在MET基因拷贝数增加（拷贝数：5.65）。研究表明，结直肠癌（CRC）患者，尤其是转移性或晚期患者中可能出现MET基因拷贝数增加。不同研究中报道的结直肠癌MET基因拷贝数增加的发生率存在差异，多数研究结果显示其发生率在 5%–20% 之间。这些研究表明，尽管MET基因拷贝数增加并非结直肠癌的普遍现象，但确实与肿瘤的恶性程度及治疗反应相关。

临床血液检测结果（表1）显示，患者癌胚抗原（CEA）水平显著升高。CEA是一种广谱肿瘤标志物，在多种恶性肿瘤中均会升高，尤其在结直肠癌（CRC）患者中升高比例较高。约70%–90%的CRC患者血清CEA水平升高，且升高程度与肿瘤分期、大小及转移情况相关：疾病早期CEA水平可能仅轻度升高；但随着疾病进展，尤其是出现肝转移等远处转移时，CEA水平会显著上升。此外，患者铁蛋白水平也升高。铁蛋白是一种负责储存大量铁离子的球形蛋白，炎症、感染、恶性肿瘤等多种病理状态均可导致其水平升高。其他血液检测指标，包括甲胎蛋白（AFP）、糖类抗原19-9（CA19-9）、同型半胱氨酸及总前列腺特异性抗原（PSA）均在正常范围内。

▲表1 临床血液检测数据

该患者采用新辅助XELOX方案进行治疗，于 2024 年 10 月 16 日启动治疗，目前已完成第 4 周期的XELOX方案全身化疗。XELOX方案是一种主要用于结直肠癌等恶性肿瘤治疗的化疗方案，由奥沙利铂和卡培他滨组成，属于临床较为常用且有效的化疗方案。但在使用过程中，需密切监测患者的治疗反应，并及时处理可能出现的不良反应。截至本文撰写时，该患者仍存活。

讨 论

结直肠癌（CRC）是全球性的健康威胁，位列全球癌症相关死亡原因的第二位。KRAS作为最常发生突变的致癌基因，其突变在CRC中十分普遍。

KRAS基因编码一种小GTP酶，在细胞信号转导、增殖和分化中发挥关键作用。这些突变主要发生在2号外显子（G12/G13位点）或3号外显子（Q61位点），导致KRAS组成型激活，进而促进癌细胞的增殖与存活。KRAS突变通常仅发生在单个外显子上，而同一组织中同时存在第2外显子（G12/G13）和第3外显子（Q61）共突变的情况此前未见报道。

本研究报道了 1 例罕见的结直肠癌患者，其同一肿瘤组织中同时存在KRAS 3号外显子（Q61H）和2号外显子（G13D）的共突变，并对其临床病理特征进行了分析。同时，与肿瘤侵袭性、不良预后及治疗耐药相关的MET基因在该患者中也存在拷贝数增加（拷贝数：5.65）。

已有研究表明此类突变可能通过破坏GTP/GDP交换的正常调控来影响KRAS蛋白的活性，从而增强其致癌潜能。此外，不同类型的突变对信号通路的影响可能存在差异：G12/G13突变主要损害KRAS的GTP水解能力，使其维持激活状态；Q61突变则会降低GTP水解速率，导致KRAS激活时间延长，致癌信号传导增强，可能进一步引起MAPK/ERK信号通路的过度激活，进而影响肿瘤细胞的行为和治疗反应。

已知KRAS突变最常发生在2号外显子，而第3外显子突变（如Q61H）相对少见。重要的是，越来越多的证据表明，与仅存在2号外显子突变的肿瘤相比，携带3号外显子突变的肿瘤可能对西妥昔单抗等EGFR靶向治疗表现出更强的耐药性。

现有有限证据显示，与KRAS野生型或其他KRAS突变型患者相比，KRAS G12C突变的结直肠癌患者客观缓解率更低，无病生存期/无复发生存期更差。KRAS G12C突变在CRC患者中的发生率约为 3%，相关证据表明此类患者预后不良。右侧结肠肿瘤更易发生KRAS突变，但其对临床结局的影响仍需进一步研究。

目前的研究主要集中在KRAS G12C突变，而针对3号外显子突变或共突变的抑制剂治疗效果仍有待进一步探索。未来的研究可利用TCGA、cBioPortal等数据库分析KRAS共突变的发生频率和临床特征，明确KRAS第2和第3外显子共突变对细胞信号通路的影响，并开发针对KRAS共突变的特异性抑制剂，或探索联合治疗方案（如KRAS抑制剂联合MEK抑制剂）。

ARMS-PCR因检测快速、成本低廉，是KRAS突变筛查的经典方法，但其设计本身限制了仅能检测预设的热点突变（如12/13/61密码子）。本研究中观察到的主要局限性包括：对于G13D+Q61H等共突变，弱阳性结果（Ct值26–29）可能导致假阳性判断；且由于突变丰度低，扩增效率存在批次间差异。

无法明确KRAS的具体突变类型可能导致以下问题：①治疗分类错误：G12C抑制剂（如索托雷塞）具有高度特异性，而G12D/V突变可能需要其他治疗策略（如mTOR联合治疗）；②临床试验入组误差：尽管患者携带罕见的可靶向突变，但ARMS-PCR结果可能显示为“野生型”，导致其被排除在突变特异性临床试验之外。

综上，本研究分析了携带KRAS双外显子突变（3号外显子Q61H，突变丰度 21.09%；2号外显子G13D，突变丰度 6.06%）的结直肠癌患者的临床及病理特征，尝试为此类疾病的临床治疗提供客观依据。KRAS双外显子突变的病例极为罕见，需要更大样本量的研究来验证这些发现。

参考文献：Peng H, Yao H, Jiang X, Zhu H, Li J, Tang H. The clinicopathological characteristics of co-mutations in exon 2 and 3 of the KRAS gene in patients with colorectal cancer. Pathol Res Pract. 2025 Jun;270:155990. doi: 10.1016/j.prp.2025.155990. Epub 2025 Apr 24. PMID: 40288235.