科研 | 浙大一院：口腔微生物群与人类免疫缺陷病毒感染者的免疫恢复有关(国人佳作)

编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读   口腔微生物群在HIV感染者中的作用值得关注，因为HIV感染或抗逆转录病毒疗法 (ART) 可能对口腔微生物群的多样性和组成产生影响。然而，很少有研究涉及口腔微生物群及其与HIV感染者对ART的不同免疫反应的相互作用。在30名没有合并症的HIV感染免疫应答 (IR) 和34名免疫无应答者 (INR) 中研究了唾液微生物群和免疫激活（在HIV-1病毒抑2年后，分别为≥500和< 200 CD4 + T 细胞计数/μl）。宏基因组测序显示，IR组和INR组呈现出相似的唾液细菌丰富度和多样性。INR组的Selenomonas_4属的丰度显著增加，而IR组的Candidatus_Saccharimonas和norank_p_Saccharimonas的丰度更高。Candidatus_Saccharimonas 和norank_p_Saccharimonas与当前的 CD4 + T 细胞呈正相关。Candidatus_Saccharimonas与适应性免疫标志物 CD4 + CD57 + T 细胞呈正相关，而norank _p_Saccharimonas与CD8 + CD38 + T细胞以及CD4/CD8 + HLADR + CD38 + T细胞呈负相关。本研究的结论是，免疫应答者和免疫无应答者的整体唾液微生物群结构相似，而唾液细菌组成存在一些分类学差异。Selenomona_4、Candidatus_Saccharimonas和norank_p_Saccharimonas可能是免疫缺陷患者免疫恢复的重要因素，而Candidatus_Saccharimonas在未来可作为筛选HIV感染者免疫反应的生物标志物。  

论文ID

原名：Oral Microbiota Is Associated With Immune Recovery in Human Immunodeficiency Virus-Infected Individuals

译名：口腔微生物群与人类免疫缺陷病毒感染者的免疫恢复有关

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064  

发表时间：2021.12

通讯作者：解奕瑞，朱彪 

通讯作者单位：浙江大学医学院附属第一医院，传染病诊治国家重点实验室

DOI号：10.3389/fmicb.2021.794746 

实验设计

结果

1 病人的一般临床特征

横断面研究对象包括30例HIV感染的免疫应答者和34例HIV感染的免疫无应答者。性别、年龄、体重指数（BMI）和吸烟状况等特征在两组之间相对匹配（表1）。MSM传播途径率为53.3%对44.1%（p=0.461）。

ART药物由两种核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂（NRTIs）和一种非核苷逆转录酶抑制剂（NNRTI）或利托那韦增强的蛋白酶抑制剂（PI）组成。IR组和INR组的ART持续时间和ART药物类型无差异（p=0.193和p=0.821）。在所有患者样本中，HIV RNA病毒载量水平被认为是无法检测到的（<20 copies/ml）。在IR组中，最低点CD4+T细胞的数量远远高于INR组（298 vs.42.5，p<0.001）（表1）。

表1. 临床特征数据汇总。

使用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验比较连续变量。分类变量采用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。BMI, 体重指数；MSM, 男同性恋者；NNRTI，非核苷逆转录酶抑制剂；PI, 蛋白酶抑制剂；IR, 免疫应答者；INR，免疫无反应者。粗体值表示P<0.05。

2 免疫应答者和免疫无应答者组的唾液微生物群分析

为了表征唾液微生物群组成，从所有64名参与者中获得了3,884,775个高质量的16S rRNA序列。采用平均445 bp的长度和平均每个样本60,700个序列进行进一步分析。在OTU表上对每个样本进行了27,986次读取，以避免任何方法学伪影。具体而言，IR组中的504个OTU和INR组中的503个OTU被证实有97%的相似度。随后分析了OTU水平各组唾液微生物群的多样性（Sobs指数、Simpson's index of多样性和Shannon指数）和丰富度（Chao1、ACE estimator和Good's coverage），与INR组相比，IR组呈现相似的Alpha和Beta多样性（表2）。从Bray-Curtis矩阵的主坐标 (PCoA) 分析中可以看出，两组之间没有显著差异（PERMANOVA，pseudo-F：1.64608，R2 = 0.02586，p = 0.109，图 1）。图2显示了口腔微生物组中属水平上优势类群的相对丰度。为了确定导致两组之间区分唾液微生物群差异的关键系统发育型，线性判别分析 (LDA) 效应进行大小（LEfSe），阈值为2。INR 组的Selenomonas_4属的丰度显著更高，而IR组的Candidatus_Saccharimonas、norank _p_Saccharimonas和Desulfobulbus的丰度更高（图 3）。Wilcoxon 秩和检验也用于检测两组之间相对丰度存在显著差异的分类群（使用置信区间法）。在门水平上，IR组中糖单胞菌的丰度比 INR 组更丰富（图4A）。与INR组相比，IR组Candidatus_Saccharimonas和norank_p_Saccharimonas的丰度显著增加，而IR组Selenomonas_4属的丰度显著降低（图4B）。

表2. 唾液微生物群16S rRNA基因高通量测序数据总结。

#表明多样性和丰富度是在每个样本的读取数相等后计算的。IR,免疫应答者；INR,免疫无应答者。

图1. IR和INR组唾液微生物群的主坐标分析（PCoA）。免疫应答者（IR）组和免疫无应答者（INR）组之间的细菌群落无显著差异。IR,免疫应答者；INR，免疫无反应者。

图2. IR和INR组中属水平的唾液微生物群组成。IR,免疫应答者；INR，免疫无反应者。

图3. IR和INR组的线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析。免疫无应答者（INR）组中重要分类群的LDA得分以阳性量表（红色）表示，而LDA阴性得分则表示免疫应答者（IR）组中丰富的分类群（蓝色）。IR, 免疫应答者；INR，免疫无反应者。  

图4. 在门和属水平上，IR和INR组之间唾液微生物类群的差异。进行Wilcoxon秩和检验，以检测两组在门（A）和属水平（B）的相对丰度上存在显著差异的分类群（使用置信区间法）。IR,免疫应答者；INR，免疫无反应者*P<0.05和**P<0.01。

3 免疫应答组和免疫无应答组适应性免疫和细菌易位标志物的比较

正如预期的那样，INR组的当前CD4+T细胞计数和CD4/CD8比率低于IR组（p<0.001）。INR组CD8+CD38+T细胞和CD8+CD57+T细胞的比例明显高于IR组（p=0.032和p=0.001）。在INR组和IR组中，CD4+免疫激活（CD4+T细胞通过表达CD25+、HLA-DR+、CD38+或HLA-DR+/CD38+）的比例水平相似。通常用作驱动慢性免疫激活的主要抗原的脂多糖（LPS）在INR组显著高于IR组（p=0.027）（表3）。

表3. 适应性免疫和细菌易位标记的比较。

IR, 免疫应答者；INR，免疫无反应者。粗体值表示P<0.05。

4 口腔微生物组与适应性免疫之间的关联

Spearman相关性检验用于研究不同属的相对丰度与适应性免疫标记物之间的相关性。通过 FDR 校正p值，低于0.05且ρ值高于0.2的p-adjust值被认为是相关的，如图5所示。由于两组Selenomonas_4属的丰度较低，因此未进行多重相关分析。Candidatus_Saccharimonas和norank _p_Saccharimonas与当前的CD4 + T 细胞呈正相关（p-adjust分别为0.033和0.025）。Candidatus_Saccharimonas与适应性免疫CD4 + CD57 + T细胞的标志物呈正相关（p-adjust = 0.049），而 norank _p_Saccharimonas与CD8 + CD38 + T细胞和CD4/CD8 + HLADR + CD38+ T细胞呈负相关，分别（p-adjust分别为 0.001 和 0.032）（图5）。为了探索唾液微生物组在区分IR和INR状态方面的潜在功能，基于微生物组创建了一个随机森林模型，前5个属如图6A 所示。ROC分析表明Candidatus_Saccharimonas可用于区分IR和INR组[ROC 图 AUC 值为 0.7 (95% CI, 0.56–0.83)，图6B]。

图5. 唾液微生物群与适应性免疫标记物之间的双向相关网络分析。一些适应性免疫标记物与唾液微生物群的特定属相关。正相关显示在红线中，负相关显示在绿线中。使用Spearman相关，p-adjust低于0.05和ρ-值高于0.2的相关性被认为是相关的。

图 6 . Candidatus_Saccharimonas 可用于区分 IR 和 INR 组。 在属级（ A ）和接收操作曲线分析（ B ）上进行可变重要性条形图 [ 曲线下面积（ AUC ） =0.7] 。 对角线表示随机分类（ AUC=0.5 ）。

讨论

众所周知，宿主与微生物群之间存在动态相互作用，这是影响人们健康的主要因素。目前可用的研究已经证实，唾液微生物群组成的明显改变是一系列全身性疾病所固有的。对人类免疫系统疾病（如RA、ALL和HIV）的口腔微生物群的研究也表明，口腔微生物群与免疫缺陷患者的免疫反应密切相关。此外，口腔微生物群与对ART的不同免疫反应相关的假设得到了HIV感染患者机会性口腔感染的高频率及其与CD4+T细胞水平的关联的支持。

如前所述，口腔微生物群在HIV感染患者中的作用值得关注，因为口腔微生物群的多样性和组成可以通过HIV感染或ART改变；然而，结果是高度可变的。以前的研究已经观察到唾液微生物群的结构大致相似，以及HIV感染受试者和未感染对照组之间几种细菌类群的相对丰度存在差异。然而，在HIV感染者和未感染者之间的唾液细菌群落中的几项研究也发现了显著差异。此外，一些研究报告了抗逆转录病毒治疗前后HIV感染者唾液细菌群落的流行和分布存在显著差异。很少有研究涉及口腔微生物群与HIV感染者接受的对ART的不同免疫反应的相互作用。在本文中，我们展示了口腔微生物群结构及其与HIV感染中免疫反应的关系。 

先前的一项研究表明，在接受24周的抗逆转录病毒治疗后，CD4+T细胞计数持续低的三名HIV感染参与者的唾液微生物组的细菌丰富度和Shannon多样性显著提高；与那些保持或恢复到大于200个细胞/μl的CD4计数相比。几个具有不同丰度的分类群，如卟啉单胞菌属，区分基线和后处理样本；这表明唾液微生物组可能是该研究中ART后CD4+T细胞计数恢复的重要因素。

然而，这项研究的主要局限是研究对象数量不足和接受抗逆转录病毒治疗的患者时间短。因此，有必要对更大的队列进行更多的研究，以更好地了解对ART的不同免疫反应对口腔微生物组的潜在作用。充分利用唾液采样的无创和无可疑功能，我们从感染艾滋病毒的免疫无应答者和免疫应答者中采集唾液样本，并采用高通量测序技术研究唾液微生物组。据我们所知，这是第一项充分利用下一代测序技术来表征和比较大量HIV感染免疫应答者和非应答者中唾液微生物群落组成的研究。鉴于对所有参与者进行了适应性免疫标志物评估，这些发现尤其重要，为评估唾液微生物群与免疫应答者和无应答者的免疫标志物之间的关系提供了机会。 

在本研究中，与INR组相比，IR组呈现出相似的唾液细菌丰富度和多样性。在之前的一项研究中，HIV感染的IR（n = 18）和INR（n = 9）个体也描述了唾液细菌群落的类似Alpha多样性。而另一项研究报告称，与CD4 + T细胞计数高于200 个细胞/μl。它声称HIV感染和高效抗逆转录病毒疗法 (HAART) 对唾液微生物定植和组成有显著影响，HAART后硒单胞菌明显增加，在HIV相关牙周炎的口腔微生物组中，这些细菌被耗尽。对于系统性红斑狼疮(SLE)患者，硒单胞菌数量增加与炎性细胞因子IL-6、IL-17和IL-33水平升高直接相关。在这项研究中，当我们在口腔微生物组的属水平上可视化优势类群的相对丰度时，我们发现INR组的Selenomonas_4属的丰度显著更高。

据报道，在大鼠急性坏死性胰腺炎中肠道念珠菌属减少，这表明念珠菌属在维持正常肠道功能方面确实发挥了重要作用。先前发表的一项研究表明，在佐剂诱导的关节炎大鼠模型中，肠道念珠菌属的相对丰度与钙粘蛋白11、IL-17α和TLR2的表达水平呈负相关。在本研究中，与INR组相比，IR组的Candidatus_Saccharimonas和norank _p_Saccharimonas属的丰度更高。

此外，Candidatus_Saccharimonas与CD4 + T细胞和CD4 + CD57 + T细胞呈正相关，而norank _p_Saccharimonas与CD4 + T 细胞呈正相关，但与CD8 + CD38 + T细胞和CD4/CD8 + HLADR + CD38+T细胞呈负相关。虽然宿主生物标志物受到个体生物学变异的影响，但口腔微生物组在无关个体中相对保守。唾液分析的最新进展在定义用于人类免疫系统疾病诊断、预后和治疗的生物标志物方面发挥了关键作用。唾液中特定微生物群落的扩张可能是潜在免疫炎症过程的印记，尤其是在HIV中。该研究表明，Selenomona、Candidatus_Saccharimonas和norank_p_Saccharimonas都可能在免疫缺陷患者的免疫恢复中发挥重要作用，并且Candidatus_Saccharimonas可以在未来被考虑作为HIV感染者免疫反应的筛选生物标志物，从而导致未来的设计有效的个体化治疗策略，例如针对免疫无反应者的益生菌。

然而，先前一项关于益生元对具有多种免疫发病机制的HIV感染患者唾液微生物群的影响的研究表明：心绞痛链球菌与CD4+T细胞相关，Veillonella parvula与CD4+CD25+T细胞相关，Prevotella pallens、Prevotella copri和Prevotella nigrencens分别具有CD4+CD25+T细胞、CD4+CD57+T细胞和CD4+HLADR+CD38+T细胞等适应性免疫标志物。结果不一致可能是由于两项研究的受试者数量不同以及对INR的定义不同造成的。需要进行更多的研究来确定这种不一致的确切原因。 

这项研究提供了对口腔微生物谱及其与免疫功能低下患者免疫反应关系的更好理解。尽管观察到唾液微生物群与适应性免疫生物标志物之间的相关性，但我们无法确定HIV感染患者口腔微生物群与免疫系统之间的因果关系。因此，仍需要进一步研究免疫系统与口腔微生物群之间相互作用的确切机制。我们发现参与者人数少、缺乏对照组和横断面分析导致对我们研究结果的解释受到限制。人内变异性将需要对对照组进行更大规模的纵向研究，其中应包括斑块收集和观察导致人内变异性随时间推移的临床和环境变化。除了分类学特征外，应该有更多关于确定细菌途径和由此产生的促进疾病和免疫的代谢物的研究。 

总之，本研究侧重于整体口腔微生物群结构及其与对ART的不同免疫反应的相互作用。虽然唾液细菌组成存在一些分类学差异，但结果表明免疫应答者的唾液微生物群的整体结构与免疫无应答者的相似。Selenomona_4、Candidatus_Saccharimonas和norank_p_Saccharimonas可能是免疫缺陷患者免疫恢复的重要因素，而Candidatus_Saccharimonas在未来可考虑作为HIV感染者免疫反应的筛选生物标志物。