科研丨浙医一院: 肠道微生物群的磷脂代谢物通过CD1d依赖性γδ T细胞促进缺氧诱导的肠道损伤(国人佳作)

编译：微科盟张嘻嘻，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

胃肠功能障碍是急性高原病(AMS)的常见症状。肠道微生物群和γδ T细胞在肠道疾病中起着关键作用，然而，缺氧诱导的肠损伤中微生物群和γδ T细胞之间的机制联系尚不清楚。在本研究中，使用抗生素耗尽微生物群后可显著减轻缺氧诱导的肠道损伤。缺氧通过促进抗菌肽血管生成素-4的分泌调节肠道微生物群组成。缺氧后小鼠肠道中梭菌属XIVa(Clostridium XIVa)的丰度显著降低，而脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的丰度则显著增加。此外，脱硫弧菌衍生的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱可促进γδ T细胞活化。与缺氧条件下的野生型小鼠相比，CD1d缺陷小鼠的上皮内IL-17A和γδ T细胞水平以及肠道损伤显著降低。从机制上讲，脱硫弧菌的磷脂代谢物通过肠上皮CD1d呈递，诱导产生IL-17A的γδ T细胞增殖，从而加重肠损伤。综上所述，肠道微生物群衍生的代谢物可通过CD1d依赖性γδ T细胞促进缺氧诱导的肠道损伤，表明磷脂代谢物和γδ T细胞可作为AMS的治疗靶点。  

论文ID

原名：Phospholipid metabolites of the gut microbiota promote hypoxia-induced intestinal injury via CD1d-dependent γδ T cells

译名：肠道微生物群的磷脂代谢物通过CD1d依赖性γδ T细胞促进缺氧诱导的肠道损伤

期刊：Gut Microbes

IF：9.434

发表时间：2022.7.27

第一作者：李彧钰

通讯作者：刁宏燕，李兰娟

通讯作者单位：浙江大学医学院附属第一医院

DOI号：10.1080/19490976.2022.2096994

实验设计

结果

1.缺氧时肠道菌群的改变可加重肠道损伤

本研究使用5.0%氧浓度环境饲养小鼠48小时，以此建立急性高原病(Acute Mountain Sickness，AMS)缺氧模型。为了研究肠道微生物在AMS发生和发展中的作用，我们首先观察了口服复合抗生素(4Abx)或无菌水后缺氧(5.0%氧浓度)模型和常氧(20.9%氧浓度)模型的肺、肠组织的表型变化(图1a)。如图1所示，用抗生素治疗的小鼠可显著防止缺氧引起的肠道损伤和肺水肿。为了表征急性高原反应的程度，我们观察了肺部的组织学变化和含水量，结果显示，与无菌水喂养对照组相比，接受抗生素治疗的小鼠肺水肿程度减轻(图1b,c)。与无菌水喂养小鼠相比，抗生素喂养小鼠表现出轻微的疾病过程，肠绒毛缩短、 炎性细胞浸润和肠壁变薄程度均显著减少(图1d)。此外，在缺氧期间接受抗生素喂养的小鼠中，紧密连接蛋白(如claudin-1、ZO-1)的表达有升高的趋势(图1e,f)。我们还使用通透性标志物FITC-葡聚糖评估了肠道通透性，结果表明，与无菌水喂养对照组相比，抗生素治疗小鼠在缺氧期间的血清FITC-葡聚糖浓度显著降低(图1g)。同时，用抗生素治疗的缺氧小鼠的血清LPS水平显著降低(图1h)。此外，与无菌水喂养小鼠相比，抗生素喂养的小鼠肠道细胞凋亡明显减少(图1i)。与其肠道屏障功能相对，促炎因子IL-6和IL-17A在缺氧条件下显著升高，而联合抗生素治疗可部分抑制促炎因子水平升高(图1j)。上述结果表明，清除肠道菌群可以延缓AMS的进展。

为了确定肠道菌群的改变是否与疾病过程有关，我们还检测了移植缺氧和常氧小鼠粪便微生物群后小鼠的表型变化(图S1a)。接受缺氧小鼠粪菌移植的小鼠显示出比接受正常小鼠粪菌移植小鼠更严重的肠道损伤(图S1b)。同样，在移植缺氧小鼠粪便的小鼠中，观察到紧密连接蛋白减少(图S1c，d)、肠细胞凋亡显著增加(图S1e)以及促炎因子水平升高(图S1f)。结合使用抗生素混合物或粪菌移植小鼠的研究结果，这些数据表明，肠道菌群对促进AMS的发展有深远的影响。

图1 肠道微生物组的消耗可减轻缺氧引起的肠道损伤和肺水肿。(a)SPF小鼠示意图，口服灌胃联合抗生素(4Abx)或无菌水(Ctrl)7天，然后缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)环境持续饲养48小时(n=3–6)。(b)不同处理组肺组织病理学分析，H&E染色的代表性图片。比例尺：50 μm。(c)使用(湿-干)/湿重比测量整个肺的含水量。(d)不同处理组小肠组织的组织病理学分析，H&E染色的代表性图片，比例尺：100 μm。(e)实时qPCR分析肠上皮组织中claudin-1、ZO-1和ZO-2基因表达。(f)对claudin-1和ZO-1进行免疫荧光染色以检查肠道屏障功能。绿色：claudin-1或ZO-1；蓝色：DAPI。比例尺，100 μm。(g)灌胃给药后小鼠血清FITC-葡聚糖浓度。(h)ELISA分析小鼠血清中LPS浓度。(i)TUNEL免疫荧光染色检测凋亡细胞。红色：TUNEL阳性细胞核；蓝色：DAPI。比例尺，100 μm。(j)实时qPCR分析肠上皮组织中IL-6和IL-17A基因表达。数据使用平均值±SEM显示。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001(单因素方差分析，Tukey事后检验)。HO，缺氧；NO，常氧；Ctrl，对照；FD4，FITC-葡聚糖4；LPS，脂多糖；ns，无统计学差异。

2.缺氧显著降低了肠道中梭菌XIVa的丰度并增加了脱硫弧菌的丰度

为了进一步探讨肠道微生物群在缺氧诱导的肠道损伤中的作用，我们通过16S rRNA基因测序分析了缺氧和常氧小鼠肠道微生物群落组成的差异。在门水平上，缺氧小鼠中厚壁菌门(Firmicutes)的丰度显著增加，同时拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)的丰度降低(图2a)。在属水平上，缺氧组的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和Alloprevotella丰度高于对照组，而梭菌属(Clostridium)的丰度降低(图2a)。非加权主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)也表明缺氧和常氧小鼠之间存在显著差异(图2b)。此外，火山图分析显示了属的差异，包括5个上调菌属和9个下调菌属(图2c)。此前已有研究表明，Clostridium XIVa(C. XIVa)可通过诱导产生IL-10的Treg细胞群来抑制肠道炎症。此外，作为肠道中最丰富的硫酸盐还原菌，脱硫弧菌可通过产生硫化氢和乙酸盐而促进IBD的发生和发展。基于这些发现，结合本研究的16S rRNA基因测序分析结果，我们发现脱硫弧菌在缺氧小鼠肠道中明显升高，而C. XIVa则在健康小鼠肠道中富集(图2c-e和图S2a)。此外，在LEfSe分析中也观察到类似的趋势(图S2b)。

3.缺氧通过促进血管生成素-4的分泌来调节肠道菌群组成

16S rRNA测序分析表明，肠道中脱硫弧菌属和C. XIVa(包括Clostridium bolteae)的丰度之间存在显著负相关关系(图S2c)。为了进一步证实二者的关系，本实验每天给小鼠口服灌胃Clostridium bolteae，连续7天。数据显示，C. bolteae灌胃小鼠肠道中脱硫弧菌的相对丰度显著降低，表明C. XIVa可能抑制脱硫弧菌生长(图2f)。接下来，我们探讨了缺氧如何抑制C. XIVa的生长。由于已知共生菌群由抗菌肽(AMPs)直接调节，我们首先测量了肠上皮层中AMPs的表达。结果表明，缺氧小鼠肠上皮层中编码磷脂酶A2(PlA2)和血管生成素-4(Ang4)的mRNA表达上调，而再生胰岛衍生3γ(Reg3g)和再生胰岛衍生的3β(Reg3b)的表达下调(图2g)。此外，Ang4的表达与C. XIVa的相对丰度呈负相关(图2h)，并且Ang4显著抑制了C. bolteae的生长(图2i)。这些结果表明，缺氧期间肠道中增加的Ang4抑制了C. XIVa的生长，从而削弱了对脱硫弧菌的抑制作用，导致脱硫弧菌丰度增加。

图2 缺氧可改变肠道微生物群的组成，并与抗菌肽相关。(a-d)对在缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)环境中饲养48小时的SPF小鼠(n=6)盲肠内容物进行16S rRNA分析。(a)肠道微生物群在门水平和属水平上的相对丰度。(b)基于操作分类单元相对丰度(97%相似性)的主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)。(c)差异表达属的火山图。(d)通过16S rRNA基因测序分析常氧和缺氧小鼠盲肠内容物中C. XIVa和脱硫弧菌的相对丰度。(e)通过实时qPCR对常氧和缺氧小鼠盲肠内容物中C. XIVa和脱硫弧菌的相对丰度进行量化分析(n=6)。(f)SPF小鼠口服C. bolteae 7天后脱硫弧菌的实时qPCR分析(n=6)。(g)实时qPCR分析肠上皮组织中抗菌肽Pla2、Ang4、Reg3g和Reg3b基因表达(n=6)。(h)C. XIVa相对含量与SPF小鼠肠道中Ang4或Pla2的相对表达之间的相关性分析(n=8)。(i)分光光度法测定重组Ang4(各5 μg/ml)刺激后不同时间点C. bolteae生长(n=3)。数据通过平均值±SEM显示。*p<0.05，**p<0.01，通过非配对t检验分析(d，e，g，i)、配对t检验(f)或线性回归分析(h)。ns，无统计学差异。

4. γδ T细胞衍生的IL-17A促进缺氧诱导的肠道损伤

IL-17不仅可以通过诱导细胞因子、趋化因子以及介导肿瘤相关炎症来促进粒细胞的分化和迁移，还可以通过调节细胞介导的免疫应答参与针对感染的保护性免疫。以往研究表明，肠道微生物群可以诱导IL-17A的表达，但其在缺氧诱导的肠道损伤中的作用尚未明确。我们的结果显示，缺氧小鼠小肠中IL-17A的产生显著增加(图1j)。此外，与WT小鼠相比，IL-17A缺陷小鼠在缺氧条件下肠道损伤显著减少(图3a)，紧密连接蛋白水平增加(图3b)。同时，与野生型小鼠相比，IL-17A缺陷小鼠在缺氧期间，其血清FD4和LPS水平显著降低(图3c-d)。综上所述，这些数据表明IL-17A可能在缺氧介导的肠道损伤中发挥主要作用。为了进一步探索缺氧诱导的肠道损伤中肠道微生物群介导的免疫机制，我们通过流式细胞术分析了缺氧和常氧小鼠小肠上皮层中产生IL-17A的免疫细胞。结果显示，缺氧小鼠肠道中γδ T细胞的丰度显著增加，但辅助性T细胞17(Th17)、自然杀伤细胞(NK)和NKT细胞的比例没有差异(图3e)。此外，在小鼠急性缺氧暴露后，γδ T细胞仅在小肠上皮层显著增加，而在其他免疫器官中没有显著增加(图S3a)。此外，与常氧小鼠相比，缺氧小鼠小肠上皮层γδ T细胞的活化标志物(如CD44和CD69)升高(图3f)。γδ T细胞的增殖和激活显示出强大的IL-17A生成能力(图3g)。与常氧小鼠相比，缺氧小鼠肠上皮中较高比例的γδ T细胞对RORγt呈阳性，RORγ是γδ T细胞分泌IL-17A的关键转录因子(图3h)。另一方面，γδ T细胞产生IFN-γ的水平在缺氧和常氧小鼠之间没有显著差异，转录因子T-bet的表达也没有显著差异(图3g和图S3b)。值得注意的是，缺氧后IL-17阳性细胞中CD4+ T、CD8+ T、NKT和NK细胞的比例无明显变化。γδ T细胞是缺氧小鼠小肠中IL-17A的最高产生者 (图3i)。为了评估γδ T细胞在肠道屏障破坏和促进损伤中的功能重要性，小鼠在暴露于缺氧环境之前注射了抗γδ T细胞的单克隆抗体。结果表明，抗γ/δTCR抗体能有效抑制肠道中的γδ T细胞(图S3c)，并显著抑制肠道损伤的进展(图S3d-f)。综上，这些数据表明，γδ T细胞是急性缺氧时IL-17A的主要产生者，其在肠上皮层聚集可加重缺氧诱导的肠道损伤。

图3 小肠上皮组织中γδ T细胞的增殖和激活及IL-17A的产生可促进缺氧诱导的肠道损伤。(a-d)WT小鼠和IL-17A缺陷(IL-17A−/−)小鼠分别在缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)环境中饲养48小时(n=6)。(a)不同组小肠组织的组织病理学分析，H&E染色的代表性图片。比例尺：100 μm。(b)实时qPCR分析肠上皮组织中claudin-1、ZO-1基因表达水平。(c)灌胃给药后小鼠血清中FITC-葡聚糖浓度。(d)ELISA分析小鼠血清中LPS浓度。(e-i)将WT小鼠暴露于缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)环境中饲养48小时(n=6)。(e)通过流式细胞术检测小肠上皮层中γδ T、NK、NKT和Th17细胞的凋亡水平。(f)分析常氧小鼠(蓝色)和缺氧小鼠(红色)小肠上皮γδ T细胞中CD44和CD69的表达水平。(g)分析常氧小鼠(蓝色)和缺氧小鼠(红色)小肠上皮γδ T细胞中IL-17A和IFN-γ的表达。(h)分析常氧小鼠(蓝色)和缺氧小鼠(红色)小肠上皮γδ T细胞中RORγt的表达。(i)流式细胞术分析小肠上皮IL-17A阳性细胞中γδ T、CD4+T、CD8+ T、NKT和NK细胞的比例。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。FD4，FITC-葡聚糖4；LPS，脂多糖；ns，无统计学差异。

5.脱硫弧菌可激活γδ T细胞产生IL-17A

我们进一步研究了图2中提到的属，发现脱硫弧菌的丰度与γδ T细胞的比例及IL-17A的产生显著正相关，而C. XIVa则相反(图4a,b)。为了探讨肠道微生物群是否会影响γδ T细胞的增殖和IL-17A的产生，如前所述，我们使用复合抗生素对小鼠肠道菌群进行清除。经抗生素治疗的小鼠中γδ T细胞比例和IL-17A的产生均显著降低(图4c,d)。此外，与PBS处理的对照小鼠相比，灌胃Desulfovibrio piger的小鼠γδ T细胞比例更高，IL-17A产量更高(图4e,f和图S3g)。同时，D. piger刺激后γδ T细胞IL-17A的比例显著增加(图4e,f)。这些结果表明，在急性缺氧期间，肠道中的脱硫弧菌可促进γδ T细胞增殖和IL-17A分泌，从而加重缺氧诱导的肠道损伤。

图4 共生微生物诱导γδ T细胞增殖和IL-17A产生。(a)SPF野生型小鼠中C. XIVa或脱硫弧菌的相对丰度与肠上皮内γδ T细胞数量之间的相关性(n=10)。(b)SPF野生型小鼠中C. XIVa或脱硫弧菌的相对丰度与肠上皮内γδ T17细胞数量之间的相关性(n=10)。(c-d)采用流式细胞术测定无菌水或4Abx处理小鼠的小肠上皮层γδ T细胞(c)和IL-17A产生(d)的占比。图中显示了代表性图片和定量数据(n=6)。(e-f)4Abx处理的小鼠在灌胃D. piger或PBS后缺氧(5.0%氧浓度)条件下饲养48小时(n=6)。(g-h)小肠上皮层细胞与D. piger共培养3天。流式细胞术测定γδ T细胞的占比和IL-17A的产生(n=6)。*p<0.05表示有统计学差异。

6.脱硫弧菌以CD1d依赖性方式激活肠上皮内γδ T细胞

γδ T细胞可通过不同的方式被微生物激活，包括细菌直接刺激和CD1d分子呈递的细菌脂质抗原识别。为了探索脱硫弧菌促进肠上皮γδ T细胞增殖和活化的机制，我们首先构建了CD1d缺陷小鼠AMS模型，并观察其表型变化。结果表明，CD1d缺陷小鼠对缺氧引起的肠道损伤和肠道屏障破坏具有部分抗性(图5a,b)。同时，与野生型小鼠相比，CD1d缺陷小鼠缺氧时血清FD4和LPS水平显著降低(图5c-d)。在缺氧条件下，与野生型小鼠相比，CD1d缺陷小鼠的γδ T细胞比例降低，IL-17Α产生减少(图5e,f)。此外，在CD1d缺陷小鼠的肠上皮层中，γδ T细胞在产生IL-17A的细胞中的比例也下调(图5g)。这一发现表明CD1d可能参与γδ T细胞的增殖。然而，我们进一步发现，在缺氧小鼠和常氧小鼠之间，代表上皮细胞的CD45阴性细胞中CD1d阳性细胞的比例没有差异，代表上皮内白细胞的CD45阳性细胞也是如此(图5h)。值得注意的是，无论氧浓度如何，CD1d表达细胞中CD45阴性细胞的比例均高于CD45阳性细胞(图5i)。此外，相应的细胞数量也呈现出相同的趋势，表明小肠上皮细胞中表达的CD1d可能在缺氧诱导的肠道损伤中起着不可替代的作用(图5j)。接下来，我们证实了来自野生型小鼠小肠上皮的总细胞在用D. piger刺激后，γδ T细胞的比例显著增加(图5k)。综上所述，这些结果表明，脱硫弧菌主要通过CD1d信号介导小肠上皮γδ T细胞的增殖和活化。

图5 共生微生物群以CD1d依赖性方式激活肠上皮内γδ T细胞。(a-g)WT小鼠和CD1d缺陷(CD1d−/−)小鼠分别在缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)环境中饲养48小时(n=6)。(a)各组小肠组织的组织病理学分析，H&E染色的代表性图片。比例尺：100 μm。(b)实时qPCR分析肠上皮组织中claudin-1、ZO-1和mRNA表达水平。(c)灌胃给药后小鼠血清中FITC-葡聚糖浓度。(d)ELISA分析小鼠血清中LPS浓度。(e)流式细胞术检测小肠上皮γδ T细胞的频率。(f)分析小肠上皮层γδ T细胞中IL-17A的表达水平。(g)流式细胞术测定小肠上皮层IL-17A阳性细胞中γδ T细胞的比例。(h-j)WT小鼠暴露于缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)环境下48小时(n＝6)。(h)流式细胞术测定小肠上皮CD45阴性或CD45阳性细胞中CD1d的表达，每组n=6。(i)流式细胞术测量小肠上皮层CD1d阳性细胞中CD45阳性或CD45阴性细胞的比例。(j)通过流式细胞术测定小肠上皮层中表达CD1d的CD45阳性或CD45阴性细胞的数量。(k)用D. piger刺激WT或CD1d-/-小鼠小肠上皮细胞3天，通过流式细胞术测定γδ T细胞频率和IL-17A产生，n=6。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。FD4，FITC-葡聚糖4；LPS，脂多糖；ns，无统计学差异。

7.来自脱硫弧菌的磷脂抗原PE和PC与γδ T细胞的增殖和活化相关

为了探索缺氧条件下影响上皮内γδ T细胞增殖和活化的关键因素，我们通过脂质代谢组学进一步分析肠内CD1d相关脂质抗原。PCA和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示，缺氧组和常氧组之间的脂质代谢产物存在显著差异(图6a)。热图分析也说明了同样的现象(图6b)。脂质抗原来源于细菌，包括PE和PC，通过CD1d分子诱导γδ T17细胞的增殖和活化。因此，我们使用代谢组学比较了缺氧和常氧小鼠盲肠内容物中PE和PC的表达水平，结果表明，缺氧小鼠肠道中PE和PC表达及其相应信号通路水平显著增加(图6c-e和图S4a,b)。此外，我们使用ELISA证实，与常氧小鼠相比，缺氧小鼠肠道中PE和PC的表达水平的确显著增加(图6f)。在施用外源性脂质抗原PE或PC后，肠上皮内γδ T细胞频率和IL-17A产生水平在Abx处理的野生型小鼠体内得以恢复，但在Abx处理的CD1d缺陷小鼠中没有恢复(图6g,h)。值得注意的是，与缺氧条件下的变化一致，腹腔注射PE或PC后，上皮层细胞因子IL-6和IL-17A的表达显著增加，表明PE和PC可以通过CD1d分子来诱导促炎反应，加重肠道损伤(图6i)。在体外共培养体系中，负载PE或PC的CD1d四聚体可刺激γδ T细胞显著增殖(图6j)。

接下来，我们结合16S rRNA基因测序和脂质代谢组学分析描述了肠道微生物群与脂质抗原之间的关系，结果表明脱硫弧菌与脂质抗原PE或PC呈显著正相关(图S4c)。为了进一步证实缺氧条件下脱硫弧菌丰度的增加是否为γδ T激活提供了更多的PE或PC，我们以脱硫弧菌属丰度最高的D. piger为例，检测了D. piger的脂质代谢物含量。ELISA结果显示，D. piger含有高水平的脂质抗原PE和PC(图6k)。总之，这些结果表明，在缺氧条件下，肠道中脱硫弧菌的增加提供了更多可由CD1d呈递的PE和PC，促进γδ T细胞的增殖和IL-17A的产生，从而加剧缺氧诱导的肠道损伤。

图6 脱硫弧菌衍生的脂质抗原PE或PC与γδ T细胞增殖和活化相关。(a-e)将SPF小鼠在缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)中饲养48小时(n=5–6)后对其盲肠内容物进行脂质代谢组学研究。(a)PCA和偏最小二乘(PLS)分析说明了脂质代谢物的差异。(b)热图显示重要脂质代谢物的相对丰度。(c)差异脂质代谢物总量的火山图。(d)差异脂质代谢物的火山图。(e)分析常氧和缺氧小鼠盲肠内容物中重要脂质代谢物的相对丰度(Top 6)。(f)通过ELISA检测缺氧和常氧小鼠盲肠内容物中PE和PC的水平(n=6)。(g-i)4Abx处理的WT或CD1d−/−小鼠腹腔注射脂质抗原PE或PC后，在缺氧(5.0%氧浓度)或常氧(20.9%氧浓度)环境中饲养48小时(n=3–6)。(g-h)流式细胞术测定γδ T细胞频率(g)和IL-17A产生水平(h)。(i)实时qPCR分析肠上皮组织中多种细胞因子的基因表达。(j)纯化的γδ T细胞与PE或PC负载的肠上皮细胞(IECs)共培养3天。通过CCK8测定γδ T细胞的增殖水平(n=6)。(k)ELISA法检测D. piger的PE或PC含量(n=3)。*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001。PE，磷脂酰乙醇胺；PC，磷脂酰胆碱。

讨论

高原反应是一种暴露于低压和低氧环境后常见的高原临床综合征，当通常居住在平原地区的个体快速进入海拔2500米以上的高原地区时，这种症状尤为常见。呼吸急促和中枢神经系统症状(如头痛和头晕)是急性高原反应的主要症状，若治疗不及时，可能发生危及生命的高原肺水肿和高原脑水肿。然而，受影响的个体在进入高原地区后也会出现恶心、呕吐和腹泻等胃肠道症状，这可能会进一步加重呼吸困难、头晕和头痛。尽管越来越多的证据表明肠粘膜损伤是胃肠道功能障碍的主要原因，但与高原相关的胃肠道反应的发病机制仍不清楚。

由于暴露于大量微生物的粘膜组织在正常生理条件下会被多种细菌群落定殖，肠道粘膜的损伤可能与菌群失衡有关。肠道共生菌群与多种疾病的发病机制密切相关，如神经系统疾病和呼吸系统疾病。以往研究表明，阿尔茨海默病与肠道中的Shigella(志贺氏菌)或氧化三甲胺呈正相关。此外，2019年冠状病毒肺炎与短链脂肪酸或L-异亮氨酸等细菌代谢物的合成受损有关。此外，肺水肿和脑水肿的发生可能不仅直接受到缺氧应激相关反应的影响，还间接受到远端肠道微生物群介导的系统免疫性调节的影响。本研究通过抗生素灌胃和粪菌移植实验证明了肠道微生物在AMS中的重要作用。结果表明，在缺氧暴露前接受抗生素鸡尾酒治疗的小鼠中，肠道损伤和肺水肿显著减少，作为肠道屏障完整性标志物的紧密连接蛋白(如claudin-1和ZO-1)的水平显著增加。同时，IL-6和IL-17A水平随疾病严重程度的变化而变化。IL-6可促进原始T细胞分化为Th17细胞，被认为是导致高原肺水肿的原因之一。本研究结果显示，IL-17A在急性高原病的进展和严重程度方面具有重要的功能。此外，从暴露于缺氧环境48小时的小鼠盲肠内容物中分离出的细菌群进行灌胃可显著加重肠道损伤，这些发现表明肠道微生物群与缺氧诱导的肠道损伤之间存在关键联系。

尽管越来越多的证据表明共生微生物群与缺氧相关疾病有关，但已发表的研究主要集中于氧化应激和主动肺泡重吸收方面。相比之下，目前尚不清楚急性缺氧后肠道菌群会发生什么变化，以及肠道菌群如何通过调节免疫细胞来调节肠粘膜保护和损伤之间的平衡。本研究结果表明缺氧后肠道菌群的组成会发生显著变化，特别是C. XIVa丰度减少和脱硫弧菌丰度增加。此外，C. XIVa在肠道中的过度定殖是Treg细胞增殖的原因，这表明该物种可以抑制炎症并保护肠道屏障的完整性。相比之下，脱硫弧菌已被证明能破坏肠道屏障，因为它们能还原硫酸盐生成硫化氢。本研究还表明，肠上皮细胞产生的抗菌肽Ang4在缺氧条件下增加，抑制C. XIVa并影响脱硫弧菌生长，而脱硫弧菌的丰度增加可加重缺氧引起的肠道损伤。

γδ T细胞可抵御外来病原体的侵袭，并在生理条件下保护粘膜屏障的完整性，然而，许多研究也表明γδ T细胞负责驱动炎症反应，参与感染性疾病和肿瘤的发病机制。本研究揭示了小肠上皮内γδ T细胞在肠道共生细菌激活后在促进缺氧诱导的肠道损伤中起关键作用。与对照组相比，我们观察到缺氧组上皮内γδ T细胞的比例显著增加，并且上皮内γδ T细胞是IL-17A的主要来源，这与核转录因子RORγt上调相关。与对照组相比，缺氧组不仅γδ T细胞的丰度增加，而且这些细胞表面的CD44和CD69表达也增加。有趣的是，缺氧条件下IL-17A的缺失或γδ T细胞的消除可部分恢复小肠上皮的完整性，表明小鼠具有抵抗缺氧诱导的肠道损伤的能力。以往研究有力地证明了γδ T细胞的增殖与局部细菌数量之间的联系。我们的结果支持了肠道细菌(特别是脱硫弧菌)可以在AMS模型中刺激上皮内γδ T细胞的增殖和IL-17A的产生，表明肠道微生物可能有助于缺氧诱导的肠道损伤。综上所述，我们的结果表明，肠道细菌刺激放大γδ T细胞反应促进缺氧诱导的肠道损伤的发展。

γδ T细胞激活不仅可以由经典抗原直接刺激，还可以由CD1d(一种非多态性MHC I类分子)呈递的脂质抗原直接刺激。CD1d分子主要表达于抗原呈递细胞、肝细胞和肠上皮细胞表面。来源于细菌的脂质抗原，如PE、PC和PG，可以通过CD1d分子呈递给γδ T细胞，从而促进其增殖、活化和细胞因子(如IL-17A)的产生。本研究表明CD1d缺陷小鼠显示出部分抵抗缺氧诱导的肠道损伤的能力。肠上皮层的多种细胞(包括上皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC))均可表达CD1d，但以上皮细胞最多。尽管添加了细菌抗原，体外培养的γδ T细胞在没有肠上皮细胞的情况下仍然不能被激活或增殖。上述结果表明，在缺氧诱导的肠道损伤期间，小肠上皮细胞表达的CD1d在触发急性炎症反应中起着重要作用。然而，本研究数据显示，小肠上皮细胞上表达的CD1d丰度并不随氧浓度的变化而变化。因此，我们采用非靶向脂质代谢组学分析检测粪便中CD1d呈递以激活γδ T细胞的脂质抗原。结果表明，缺氧后肠上皮内γδ T细胞的过度激活是由PE和PC等脂质抗原引起的，而非CD1d。为了进一步确定缺氧条件下脱硫弧菌丰度的增加是否提供更多的PE和PC，我们以脱硫弧菌属丰度最高的D. piger为例，检测其脂质代谢物含量。脱硫弧菌含有高水平的脂质抗原PE和PC，表明脱硫弧菌是驱动缺氧诱导的肠道损伤的重要因素。

本研究表明，缺氧期间肠道中增加的Ang4可抑制C. XIVa的生长，从而削弱了对脱硫弧菌的抑制作用，导致其丰度增加。脱硫弧菌可提供PE和PC，主要由小肠上皮细胞上表达的CD1d呈递。缺氧条件下产生的脂质抗原呈递给上皮内γδ T细胞，促使其产生IL-17A，加重缺氧诱导的肠道损伤。综上所述，这些发现表明，在缺氧时干扰微生物诱导的γδ T细胞活化可能是预防和治疗AMS的一种有潜力的方法。