生物仿制药可比性研究面临的挑战

  根据美国食品药品监督管理局（FDA）的定义，“生物仿制药是一种生物制剂，是基于与FDA已经批准的生物产品（称为参考产品或原研药）高度相似而被认可，仿制药与参考产品的安全性、纯度和有效性方面高度一致。” 在欧洲，于2003年建立了批准生物仿制药的法律框架。生长激素Omnitrope是2006年被欧洲药品管理局（EMA）批准的首个生物仿制药。目前，在欧洲市场上有21种生物仿制药产品。在美国，2010年通过了《平价医疗法案》（ACA），为“生物仿制药”产品创造了简化的许可途径，即Lovenox（依诺肝素钠）的通用版本，它是通过化学修饰肝素制成的低分子量肝素。为了使其体积更小，它实际上是在2010年通过现有的新药缩写（ANDA）程序批准的，并被人们认为是美国的第一个生物仿制药。依诺肝素可能是市场上最复杂的药物。

  首个基于ACA批准的生物仿制药是Sandoz的Zarxio™，该药物于2015年3月上市销售。Zarxio™的氨基酸序列与Amgen生产的现有蛋白治疗药物Neupogen的氨基酸序列相同，分子量18.8 kDa。美国第一个蛋白质生物仿制药Zarxio™被批准为生物仿制药肯定会为更多基于蛋白质的生物仿制药批准的制药企业打开门户。还可以预期，许多已经在欧洲市场上批准了生物仿制单克隆抗体（mAB）药物的公司将向美国FDA提交申请。

  尽管生物仿制药的产品与原研产品相似，但并非其完全的复制。FDA在2015年8月发布了“在证明参考产品生物相似性方面的科学考虑”的指南。本文中，FDA希望仿制药企业将首先对产品和参考产品进行最广泛的表征对比，因为这两种产品的广泛表征是证明生物相似性的基础。

糖蛋白类生物仿制药

对于糖蛋白（以mAb为主），以下准则在FDA指南中专门概述，以进行广泛的生物学表征：

1、一级结构，例如氨基酸序列

2、高阶结构，包括二级，三级和四级结构（包含聚集）

3、酶促翻译后修饰，例如糖基化和磷酸化

4、其他潜在的变化，例如蛋白质脱酰胺和氧化

5、有意的化学修饰，例如PEG化位点和特征。

  尽管提到糖基化只是这些标准中的一个，但它可能是证明糖蛋白治疗剂生物相似性最具挑战性的方面。这部分是由于蛋白质糖基化机制固有的异质性所决定。糖蛋白结构表征和含糖生物制剂的可比性的复杂性源于以下事实：与非糖基化蛋白相比，糖蛋白不是离散的单个分子，而是以不同复杂性的异质混合物形式出现。这种异质性完全来源于聚糖片段，并且源于其可变大小、分支、连接和被非碳水化合物部分取代。为了充分捕捉这种经常引起注意的多样性并确定原研产品及其生物仿制药的特征，有必要采用适当的实验设计和分析方法。如果未遵循正确的实验方案，则很容易错过糖型亚结构中可能存在的细微差异，并且可能对糖蛋白产生重大影响，包括其生物活性、溶解性、免疫原性、抗蛋白水解稳定性和清除率。

  市场预计将进入美国市场的下一波生物仿制药将会是抗体（AB）。AB在Fc区具有特定的聚糖修饰，这对其免疫效应功能至关重要。聚糖多样性会影响这些AB的Fc依赖性活性，任何增加的Fc唾液酸化作用都可能导致与固定抗原的结合减少，以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性也会降低。相比之下，增加的Fc唾液酸化作用增加了AB的抗炎活性。因此，重要的是能够检测和监测这些被证明对AB的生物活性很重要的聚糖部分。

  在设计解决糖蛋白糖基化可比性的策略时，实验设计需要设计特定方案，以便能够观察到这些差异（下图1）。例如，以下是捕获这些细微变化的实验设计平台，请记住，根据选择的治疗性糖蛋白，每个步骤都需要仔细考虑和修改。

图1.糖蛋白生物仿制药分析的实验设计

• HPLC和GC-MS分析单糖成分

• 通过GCMS或糖苷外切酶消化然后通过MS进行糖基链接分析

• 完全释放和分离N和O连接的聚糖

• 测序和鉴定复杂聚糖的类型

• 准确定量释放的N和O链聚糖

• 识别N和O联聚糖的连接位点

• 确定每个糖基化位点的聚糖异质性

• 量化每个糖基化位点的聚糖占有率

• 确定每个残基的异头构型

• 识别并确定非碳水化合物成分（例如磷酸盐和硫酸盐）与聚糖的连接点

  目前大多数FDA批准的糖蛋白治疗剂都是在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中生产的，而其他也有在仓鼠肾细胞、鼠骨髓瘤和杂交瘤细胞系中生产的。CHO细胞系表达复杂的N型聚糖，能够在聚糖序列的最外层携带α（2,3）连接的唾液酸，并且已知表达两种唾液酸，即N-乙酰神经氨酸（NeuAc）和非唾液酸。人N-羟乙酸神经氨酸（Neu5Gc）。从实验设计实现上述平台（下表1）的各个方面来看，挑战变得显而易见，包括鉴定和定量可能存在的任何CHO衍生的非人聚糖表位的能力，包括终端Gal-α1-3Gal和Neu5Gc。其他潜在需要分析的是一下内容：

表1.糖蛋白分析方法及其难点

a、有聚糖的释放不完全，特别是较大的唾液酸化四丁烯结构

b、准确检测和定量α（2,3）连接的唾液酸以及可能的α（2,6）连接的唾液酸

c、确定所用酶的纯度，并确保没有外切和糖苷内切酶活性污染

d、与高唾液酸化复杂类型相比，高甘露糖聚糖的定量可比，因为高甘露糖聚糖通常可能被高估

e、精确检测和定量带有末端残基（例如Gal，GalNAc，GlcNAc和NeuAc）的聚糖

f、能够区分将Glc加入到聚糖的非还原末端的可能性

g、设计实验时不要忽略任何非碳水化合物部分

h、在N / O-糖基化的每个位点进行的糖微异质性的定量比较，与整体糖定量的比较。

  上述每个难点都凸显了开发高质量碳水化合物生物仿制药候选产品的挑战，以及对专业知识和现代分析仪器的迫切需求。必须认识到这些方法的局限性和不足，在表征和可比性研究的背景下可能缺乏特异性。否则可能会导致严重的延迟，并在项目期间浪费资源。

  克服其中一些挑战的关键是双重的。首先，建立一支具有深厚专业知识和洞察力的专家团队，他们对糖蛋白表征以及应用包括高分辨率质谱法和NMR光谱法在内的最新技术的专门知识有所了解。NMR在检测细微的产物变化方面特别强大，这通常需要一系列相当复杂的2D-NMR实验，这些实验必须能够区分糖基部分，而这是MS或HPLC实验无法分辨的。由于缺乏获取和专业知识，高端NMR实验常常被忽略。

  第二，生物仿制药鉴定成功的另一个重要步骤是，制药企业要与更强大的科研机构合作，因为后者了解整个糖缀合物结构表征的挑战。与参与治疗性蛋白质和单克隆抗体鉴定的科学非营利组织密切合作，最容易实现这一目标。科研机构致力于研究，提供服务和培训动物、细菌、真菌和植物衍生的复杂碳水化合物的结构表征的组织，也包括碳水化合物生物仿制药的表征，例如低分子量肝素和抗体。某些科研机构是糖类研究的焦点，因为它提供了一些使用最先进的仪器进行碳水化合物表征的专门动手培训课程，并提供了复杂碳水化合物的研究服务，包括涵盖糖组学和糖蛋白组学。各个科研机构与其他学术机构、行业和政府机构密切合作，包括美国药典（USP）和美国国家标准技术研究院（NIST）。USP为药物的身份、质量和纯度设定标准，其药物标准可由FDA强制执行。NIST是一个测量标准实验室，为用户提供1300多种标准参考材料。这些组织共同拥有可帮助开发高质量碳水化合物生物仿制药候选产品的资源。

  总而言之，鉴于各国的医疗保健费用高昂，消费者可以从中获得更多高质量的通用仿制药，这是患者的最大利益。但是，对患者的安全至关重要的是，必须对每种生物仿制药进行全面表征，并将特定的实验设计为安全网，并将其作为表征和释放测试的一部分进行实施，以确保向市场提供高质量的生物仿制药。

文章来源：

1、U. S. Food & Drug Administration: Biosimilars [http://www.fda.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/ HowDrugsareDevelopedandApproved/ ApprovalApplications/TherapeuticBiologicApplications/ Biosimilars/]

2、U. S. Food & Drug Administration: Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product [http://www.fda.gov/downloads/ Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/UCM291128.pdf]

3、Naso MF, Tam SH, Scallon BJ, Raju TS: Engineering host cell lines to reduce terminal sialylation of secreted antibodies. MAbs 2010, 2(5):519-527.

4、Ghaderi D, Zhang M, Hurtado-Ziola N, Varki A: Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation. Biotechnol Genet Eng Rev 2012, 28:147-175.

5、Ghaderi D, Taylor RE, Padler-Karavani V, Diaz S, Varki A: Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol 2010, 28(8):863-867.

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