浙大张进团队揭示细胞周期与胚胎干细胞2C状态进入与退出的关联

2012年 Todd S. Macfarlan 等科学家发现，在体外培养的小鼠胚胎干细胞 （ESCs） 具有异质性，有约1%的细胞在基因表达与染色质调控等方面与2-细胞期胚胎相似，这群细胞具有更高的发育潜能，它们既能分化成胚胎组织，又能够分化成胚外组织，因而被称作2-细胞样细胞 （2-Cell Like Cell，2CLC） 【1】 。然而，2CLC状态是极度不稳定的，在体外培养过程中大部分2CLC会自发转换回原来的多能状态，目前对2CLC状态的退出过程的机制知之甚少。 近年来研究表明，在2C基因Dux过表达的系统中，伴随着2CLC状态的退出，多能性基因分两波依次被激活，而Dux mRNA的衰减在2CLC状态退出中起着重要作用 【2】 。然而，有关自发的2CLC状态的进入和退出的完整过程和及其相关分子机制仍未被完全阐明。 近日，浙江大学医学院基础医学系/浙江大学医学院附属第一医院 张进 课题组在 Stem Cell Reports 期刊在线发表了题为： Cell cycle heterogeneity directs spontaneous 2C state entry and exit in mouse embryonic stem cells 的研究论文。 该研究通过单细胞测序的方法描绘了小鼠胚胎干细胞从2CLC到ESC状态转变过程中转录谱的动态变化，发现不同的状态的ESC表现出不同细胞周期特征。同时阐明了依赖细胞周期的核仁结构及其相关的核仁周围异染色质重塑对于协调2CLC状态的进入和退出的重要性。  

在本研究中，作者首先利用流式分选得到2CLC，并在体外培养24小时模拟从2CLC状态退出进入ESC状态的过程，随后对其进行单细胞测序，探究2C状态进入与退出的相关机制 （图1） 。  

图1.单细胞测序技术重构2CLC到ESC相互转换的中间态 为了阐明上述细胞集群之间相互转换的路线图，作者进行了拟时间轨迹分析，进一步确定了2CLC存在两个细胞亚群, 并且发现，2C状态的进入和退出是通过不同的中间态介导的。2C状态的退出经历了2C基因ERV的表达从2C-IN，2C-OUT亚群逐渐下降，接着通过ES-IN亚群大幅下调，到ES亚群基本无表达的过程，此过程也伴随着多能性标志基因表达量的增加 （图2） 。  

图2. 2C到ESC相互转换路线的鉴定 作者进一步研究发现，各细胞亚群中G1、S和G2/M期的细胞周期比例存在显著差别，不同状态的2CLC及ESC显示不同的细胞周期特征。2C-IN亚群显著富集G1期的细胞，而2C-OUT亚群显著富集G2/M期的细胞 （图3） ，而相比较而言ES状态S期的富集增多。进一步的，通过细胞周期抑制剂进行处理，作者发现，将ESC抑制在G1期可以显著提高2C基因ERVs的表达水平，同时可以观察到染色质组装、分解和核小体组织的相关通路基因表达下调。  

图3.单细胞测序结果显示细胞周期富集密度图（左）及统计图（右）。 之前的研究显示，核仁蛋白NCL可以与TRIM28形成复合物，并抑制2C基因Dux的激活 【3】 。作者通过DNA荧光原位杂交 （DNA-FISH） 的结果显示，在CYT （G1期抑制剂） 处理后，染色体上的Dux基因座 （locus） 倾向于从核仁或周边核纤层重定位到核质中，提示研究者们Dux基因座的位置可能偏离了转录抑制的异染色质环境 （核仁周边的核纤层通常是异染色质的转录抑制环境） 。ChIP-Re-ChIP结果显示，在CYT处理后，H3K9me3在Dux位点处H3K9me3修饰水平显著降低，MERVL或ERV类基因启动子上H3K9me3信号也发生了下调。 综上，该研究揭示了与细胞周期相关的核仁周边异染色质的重塑调控Dux的表达和2C状态的激活 （图4） 。  

图4. 细胞周期介导的核仁及其周边异染色质在2C激活中的调控模型 浙江大学医学院博士生朱雨晴，科研助理程臣，研究生陈浪为本文共同第一作者。浙江大学爱丁堡联合学院Kuan Yoow Chan研究员，浙江大学医学中心傅旭东研究员及浙江大学遗传所梁洪青研究员对本文提出了宝贵意见。该项研究还得到了科技部“干细胞研究与转化”、国家自然科学基金/浙江省自然科学基金、浙江大学医学中心/良渚实验室和浙江大学医学院附属第一医院的支持。 张进 课题组长期从事代谢与干细胞命运方面的研究，实验室成立以来作为通讯作者在 Nature Metabolism、Cell Metabolism、Cell Stem Cell、Nature Communication（accepted）、Protein＆Cell, Journal of Hematology＆Oncology、Genome Biology、 Molecular Therapy 等杂志发表文章十余篇。 实验室目前的研究方向包括早期胚胎发育的代谢，干细胞分化的代谢，以及将代谢调控应用于工程化改造干细胞分化免疫细胞如Macrophage/NK的策略中。详细信息请见实验室网站https://person.zju.edu.cn/zhangstemcell。 实验室在以上方向长期招聘博士后和特聘研究员/副研究员。如有意向加盟请联系： zhgene@163.com 。 

参考文献： 1. Macfarlan TS, Gifford WD, Driscoll S, Lettieri K, Rowe HM, Bonanomi D, Firth A, Singer O, Trono D, Pfaff SL: Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity. Nature 2012, 487:57-63. 2. Xudong Fu MND, Yi Zhang: A transcriptional roadmap for 2C-like–to–pluripotent state transition. SCIENCE ADVANCES 2020, 6. 3. Percharde M, Lin CJ, Yin Y, Guan J, Peixoto GA, Bulut-Karslioglu A, Biechele S, Huang B, Shen X, Ramalho-Santos M: A LINE1-Nucleolin Partnership Regulates Early Development and ESC Identity. Cell 2018, 174:391-405 e319. 

论文链接： https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2021.09.003