青藤碱通过DNA甲基化缓解慢性炎症性疼痛的表观遗传镇痛机制

青藤碱（Sinomenine,SIN）是一种传统中药青风藤（Sinomenium acutum）来源的非阿片类生物碱，在临床上表现出镇痛效果，但其确切机制尚未完全阐明。

2026年8月5日，广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院）李奇璐博士等为第一作者、周华教授等为通讯作者，在国际权威期刊《Phytomedicine》（中科院1区Top期刊，影响因子：IF11.3）发表题为“Sinomenine alleviates chronic inflammatory pain through DNA methyltransferase 1-mediated DNA methylation of the P2X2 purinergic receptor: an epigenetic mechanism of analgesia”的高水平科研成果，揭示了青藤碱通过DNA甲基转移酶1（DNMT1）介导的P2X2嘌呤能受体DNA甲基化缓解慢性炎症性疼痛的表观遗传镇痛机制。

标题：Sinomenine alleviates chronic inflammatory pain through DNA methyltransferase 1-mediated DNA methylation of the P2X2 purinergic receptor: an epigenetic mechanism of analgesia（青藤碱通过DNMT1介导的P2X2嘌呤能受体DNA甲基化缓解慢性炎症性疼痛的表观遗传镇痛机制）

发表时间：2026年8月5日

发表期刊：Phytomedicine

影响因子：IF11.3/Q1

技术平台：DNA甲基化测序等

作者单位：广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院）、横琴实验室

DOI:10.1016/J.Phymed.2026.158692

研究摘要

研究采用完全弗氏佐剂（CFA）诱导的大鼠慢性炎症性疼痛模型及脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞神经炎症模型，结合行为学检测、功能检测、表观遗传学、药理学等多学科方法，揭示青藤碱通过表观遗传学机制发挥镇痛作用的全新通路。机制研究表明，SIN通过特异性上调DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达，促进嘌呤能受体P2X2（P2X2R）基因启动子区域高甲基化，从而抑制P2X2R转录，进而抑制下游细胞外信号调控激酶1/2（ERK1/2）信号通路和钙内流，最终减轻慢性炎症性疼痛和痛觉超敏反应。该研究首次揭示了青藤碱通过上调DNMT1抑制P2X2R的转录，导致P2X2R启动子高甲基化，最终发挥镇痛作用的分子机制，这一DNMT1依赖性通路为聚焦表观遗传调控的镇痛策略提供了新的治疗靶点。

研究亮点

青藤碱通过下调P2X2R缓解慢性炎症性疼痛

DNMT1对于青藤碱抑制P2X2R表达至关重要

揭示了DNMT1调控青藤碱镇痛的新表观遗传学机制

图形摘要：青藤碱上调DNMT1诱导P2X2R启动子高甲基化及转录抑制，从而抑制P2X2R-ERK1/2信号轴，进而缓解慢性炎症性疼痛。

研究方法

动物模型：CFA诱导大鼠慢性炎症性疼痛模型，模拟人类慢性炎症性疼痛状态。

细胞模型：LPS刺激小鼠小胶质细胞（BV2细胞）系，建立体外神经炎症模型。

行为学：机械痛阈（动态足底触觉仪、von Frey纤维丝）、热痛阈（热板仪）评估疼痛行为；足容积测定仪评估足肿胀，并进行关节炎评分。

功能检测：MTT法检测细胞活力、Griess法检测一氧化氮(NO)、ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Western blot检测蛋白表达、RT-qPCR检测mRNA水平、Fluo-4钙成像检测胞内Ca²⁺浓度。

表观遗传学研究：

全基因组甲基化测序： MeDIP-seq全基因组甲基化谱分析。

靶向重亚硫酸盐测序（Target-BS）：对P2X2R基因启动子区域进行扩增子重亚硫酸盐测序（AmpBS），精确定量DNA甲基化水平变化。

基因沉默：siRNA介导的DNMT1、DNMT3A、DNMT3B特异性敲低。

结果图形

（1）青藤碱缓解CFA诱导的慢性炎症性疼痛和超敏反应

图1：青藤碱（SIN）缓解CFA诱导的慢性炎症性疼痛和超敏反应。

A.   SIN化学结构。

B.   SIN对CFA处理大鼠机械痛阈的作用。

C.   SIN对CFA处理大鼠50%缩足阈值的作用。

D.   SIN对CFA处理大鼠热痛阈的作用。

E.   SIN给药后CFA处理大鼠足爪肿胀的代表性照片。

F.   SIN对CFA处理大鼠炎症评分的作用。

G.   CFA处理大鼠发炎足爪组织的代表性H-E染色图。

H.   SIN对CFA处理大鼠足爪水肿体积的作用。

（2）青藤碱通过下调P2X2R表达发挥镇痛作用

图2. 青藤碱（SIN）通过下调P2X2R表达发挥镇痛作用。

A-B. SIN对CFA处理大鼠脊髓和背根神经节（DRG）中IL-1β、TNF-αmRNA水平的作用。

C-D. SIN对CFA处理大鼠血清中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α水平的作用。

E. SIN对CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R mRNA水平的作用。

F. SIN对CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R蛋白表达的作用。

G-H. CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R表达免疫组织化学染色的定量分析。

I.  免疫组化染色显示CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R阳性细胞的分布。

J.  CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R蛋白的Western blot分析。

K.  免疫组化染色显示CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R阳性细胞的分布。

（3）青藤碱在BV2细胞中缓解神经炎症反应并调控P2X2R

图3：青藤碱（SIN）在BV2细胞中缓解神经炎症反应并调控P2X2R。

A.   MTT法评估SIN对BV2细胞的细胞毒性。

B.   SIN对脂多糖（LPS）刺激的BV2细胞培养上清液中TNF-α水平的作用。

C.   SIN对LPS刺激的BV2细胞中TNF-α mRNA水平的作用。

D.   SIN对LPS刺激的BV2细胞培养上清液中一氧化氮（NO）浓度的作用。

E.   SIN对LPS刺激的BV2细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白水平的作用。

F.   SIN对LPS刺激的BV2细胞中iNOS mRNA水平的作用。

G.   SIN对LPS刺激的BV2细胞中P2X2R mRNA水平的作用。

H.   SIN对LPS刺激的BV2细胞中P2X2R蛋白水平的作用。

I.   BV2细胞中各检测蛋白的Western blot结果。

（4）青藤碱通过P2X2R/ERK1/2信号轴在体内发挥镇痛作用

图4：青藤碱（SIN）通过调控P2X2R表达，改善CFA诱导大鼠的疼痛反应及炎症信号。

A. SIN对CFA处理大鼠机械痛阈的作用。

B. SIN对CFA处理大鼠50%缩足阈值的作用。

C. SIN对CFA处理大鼠热痛阈的作用。

D. CFA处理大鼠足肿胀的代表性照片。

E. SIN对CFA处理大鼠关节炎症评分的作用。

F. CFA处理大鼠发炎足爪组织的H-E染色代表性图片。

G. SIN对CFA处理大鼠足肿胀容积的作用。

H-I. SIN对CFA处理大鼠脊髓和DRG中IL-1β和TNF-αmRNA水平的作用。

J-K. SIN对CFA处理大鼠血清中炎症细胞因子IL-1β和TNF-α水平的作用。

图5：青藤碱（SIN）通过介导P2X2R/ERK1/2通路，改善CFA诱导大鼠的疼痛信号。

A-D. SIN对CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R阳性信号面积的作用。

E. SIN对CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R mRNA水平的作用。

F. Western blot。

G. SIN对CFA处理大鼠脊髓和DRG中P2X2R蛋白表达的作用。

H. SIN对CFA处理大鼠脊髓和DRG中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白表达的作用。

I-K. P2X2R蛋白表达与疼痛行为之间的相关性分析。

（5）青藤碱通过P2X2R/ERK1/2轴调控小胶质细胞中的钙内流

图6：青藤碱(SIN)通过P2X2R/ERK1/2通路减少钙内流，从而调控LPS诱导BV2细胞信号。

A-B. A317491和BZATP对BV2细胞的细胞毒性。

C-G. SIN对TNF-α水平、TNF-α mRNA、NO浓度以及iNOS和P2X2R mRNA水平的作用。

H-K. SIN对iNOS、P2X2R、NMDAR2B和p-ERK1/2蛋白水平的作用。

L.  细胞内Ca2+的相对荧光强度。

M.  BV2细胞Western blot条带图。

N.  不同处理组BV2细胞的代表性钙成像显微照片。

（6）青藤碱通过增加P2X2R的DNA甲基化水平以调控其表达

研究团队在THP-1细胞中通过全基因组甲基化测序发现，SIN可以调控P2X2R基因的甲基化水平，减少其表达。为验证这一机制在神经炎症模型中的适用性，研究在BV2细胞中采用DNA甲基转移酶抑制剂5-AzaC处理（导致全基因组甲基化水平显著降低）。结果显示，5-AzaC单独处理可整体降低甲基化水平，导致P2X2R表达较模型组进一步升高；而与SIN单独处理相比，SIN联合5-AzaC介导P2X2R mRNA水平显著升高，并呈现蛋白表达恢复趋势，表明SIN通过DNA甲基化发挥作用。进一步的靶向亚硫酸盐测序（AmpBS/Target-BS）在BV2细胞中鉴定出P2rx2位点上4个差异甲基化区域（DMRs），包含多个CpG位点。与对照组相比，LPS刺激导致这些区域CpG位点甲基化水平显著下降；而SIN处理则拮抗效应，相对于LPS模型组显著提高了P2X2R基因启动子区域多个CpG位点的甲基化水平。上述结果表明青藤碱通过提高P2X2R基因的DNA甲基化水平以抑制其转录和表达。

图7：青藤碱对P2X2R的调控作用与DNA甲基化水平升高相关。

A.   THP-1细胞中P2X2R基因的甲基化测序结果。

B.   P2X2R甲基化标签计数。

C.   BV2细胞的Western blot。

D.   5-Azac处理后BV2细胞中P2X2R蛋白和mRNA水平变化。

E.   P2X2基因差异甲基化区域（DMRs）的UCSC可视化结果。

F.   SIN处理的BV2细胞中P2X2基因差异甲基化区域内CG位点的甲基化水平。

（7）青藤碱通过DNMT1介导P2X2R抑制

图8：青藤碱（SIN）通过特异性上调DNMT1介导P2X2R表达抑制。

A-D. SIN对P2X2R、DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的作用。

E-H. SIN对P2X2R、DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白水平的作用。

I. BV2细胞的Western blot条带。

J-L. siRNA转染后不同组中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA水平变化。

M-O. 敲低DNMTs家族后不同组中P2X2R mRNA水平变化。

（8）计算分析支持DNMT1介导P2rx2增强子位点选择性甲基化

图9：DNMT1在P2rx2增强子区域位点选择性的计算分析。

A.   DNMT1周围序列偏好性评分在87个CpG位点上的分布，分为四个等级（高、中高、中低、低）。偏好性评分存在7倍差异，支持位点选择性甲基化的可能性。

B.   在53个BV2细胞可测得的CpG位点上，DNMT1偏好性评分与实验甲基化变化交叉验证散点图。

结论和启示

本研究通过体内和体外模型的行为学、生物功能学、表观遗传学等分析揭示，青藤碱（SIN）通过上调DNMT1，诱导P2X2R基因启动子区域发生高甲基化，转录水平沉默P2X2R，减少下游ERK1/2信号激活和钙内流，最终缓解慢性炎症性疼痛。DNMT1是SIN发挥此表观遗传镇痛效应的特异性必需效应分子，确立了“SIN–DNMT1–P2X2R”作为一条全新的、非阿片类镇痛通路。

启示：

P2X2R及其表观遗传调控因子DNMT1，可作为开发非成瘾性、精准镇痛药物新靶点。

研究为青藤碱提供全新、深入的分子机制解释，为其更广泛临床应用提供理论支撑。

揭示通过靶向特定基因DNA甲基化状态来治疗慢性疼痛前景，助力扩展表观遗传学药物在慢性疼痛管理中的应用。

参考文献：

Li QL, …, Dong Y, Xie Y, Yao YD, Zhou H. Sinomenine alleviates chronic inflammatory pain through DNA methyltransferase 1-mediated DNA methylation of the P2X2 purinergic receptor: an epigenetic mechanism of analgesia. Phytomedicine. 2026 Aug 5;160:158692.doi: 10.1016/j.phymed.2026.158692.