成纤维细胞中BRG1–COL16A1轴促糖尿病足创面修复机制

复旦大学附属中山医院血管外科董智慧教授团队在国际权威期刊 《Advanced Science》 （IF=14.1，中科院1区）在线发表题为“Promotion of DFU Wound Healing via BRG1–COL16A1 Axis in Fibroblasts”的研究成果。

复旦大学附属中山医院血管外科董智慧教授为通讯作者，上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科余力教授和同济大学附属同济医院创面修复科代涛教授为共同通讯作者。复旦大学附属中山医院血管外科博士研究生王鹏辉为第一作者。

研究背景

糖尿病足溃疡（DFU）因高发病率和高复发率给全球健康带来重大负担。现有的治疗方法（清创和减压等）疗效有限，深入了解糖尿病创面修复的相关分子机制尤为重要。

研究目的

通过单细胞测序和转录组分析筛选DFU愈合关键调控基因，结合体外功能实验和体内动物模型验证，系统解析BRG1-COL16A1调控轴在DFU创面愈合中的作用机制，为慢性糖尿病创面治疗提供新的分子靶点。

研究方法

DFU与健康皮肤的多组学分析鉴定出成纤维细胞来源的COL16A1是一种创面愈合关键调节因子。

体外实验通过COL16A1的过表达或敲低，评估其对成纤维细胞功能和胶原分泌能力的调控作用。

体内实验采用局部腺病毒递送COL16A1，评估其对糖尿病小鼠创面闭合的治疗效果。 研究团队系统运用DNA pull-down联合LC-MS/MS、ChIP-qPCR和荧光素酶报告基因实验，阐明COL16A1表达的上游调控机制。

项目研究

转录组分析揭示COL16A1是DFU成纤维细胞功能障碍的关键调控因子

研究团队对4例DFU患者创面皮肤样本和4例健康对照皮肤进行单细胞RNA测序联合转录组分析，共获得53,234个高质量细胞，鉴定出11个细胞群体。

GO富集分析显示，成纤维细胞中下调基因显著富集于细胞外基质（ECM）相关通路。通过整合单细胞与转录组数据，筛选出34个在两种测序模式中一致下调的差异表达基因，这些基因主要参与ECM组织调控。

蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步识别出3个基因簇，其中COL16A1与SFRP1所在的Cluster 3调控黏着斑组装——这一过程直接影响成纤维细胞的存活、迁移、收缩、信号通路及对组织微环境的响应。

单细胞转录组分析显示，COL16A1在成纤维细胞中的表达水平显著高于平滑肌细胞和角质形成细胞，且在DFU微环境中成纤维细胞的COL16A1表达较健康对照显著降低。多层面计算证据共同确立COL16A1为DFU发病机制后续机制研究的优先候选基因。

DFU创面中成纤维细胞来源的COL16A1表达受损

转录组结果得到临床样本验证：DFU组织中COL16A1的mRNA和蛋白表达水平均显著低于健康对照。

免疫荧光空间定位显示：COL16A1在健康组织中与波形蛋白强烈共定位，而在DFU组织中成纤维细胞特异性表达明显减弱。

H&E和马松染色显示：DFU病变具有明显的炎症浸润、上皮剥脱和ECM破坏。在动物模型中，野生型小鼠在创面愈合过程中COL16A1表达逐渐诱导上调，而糖尿病db/db小鼠则表现出上调受阻，与其创面闭合延迟相一致。

成纤维细胞特异性损伤进一步得到证实：糖尿病创面中COL16A1+/波形蛋白+双阳性细胞群减少，且表达水平与创面闭合率强相关。

COL16A1在维持成纤维细胞稳态和功能完整性中发挥关键作用

为验证上述观察，研究团队在低、高糖条件下培养原代小鼠真皮成纤维细胞。高糖培养的成纤维细胞表现出增殖能力降低、迁移能力受损、收缩活性减弱，同时α-SMA和TGF-β1表达受抑，ECM成分合成减少，提示细胞激活受损。这些全面的功能抑制与COL16A1表达的显著降低相吻合。

通过腺病毒过表达和siRNA敲低调控COL16A1表达进行功能相关性研究：高糖条件下，COL16A1过表达可拮抗葡萄糖诱导的功能障碍，恢复细胞增殖、迁移、收缩能力和胶原合成；反之，低糖条件下敲低COL16A1可重现高糖处理细胞中观察到的功能缺陷。这些发现证明COL16A1对于维持成纤维细胞稳态和功能完整性至关重要。

COL16A1加速小鼠糖尿病创面愈合

鉴于糖尿病创面中COL16A1的缺乏，研究团队探究局部过表达COL16A1是否能促进糖尿病小鼠的创面愈合。db/db小鼠接受创面部位皮内腺病毒注射以局部过表达COL16A1。与对照组相比，COL16A1过表达创面表现出更快的闭合速度和显著改善的愈合率。

H&E和马松染色组织学分析显示，COL16A1过表达组创面床更小、再上皮化近乎完全、胶原沉积增强。免疫荧光证实治疗小鼠真皮层COL16A1阳性信号增加，且COL16A1与成纤维细胞标志物波形蛋白存在共定位。

BRG1促进COL16A1转录和成纤维细胞激活

为探索COL16A1的上游调控机制，研究团队进行了高通量筛选以鉴定结合COL16A1启动子的转录因子。

通过DNA pull-down 联合LC-MS/MS鉴定出385个候选蛋白。与公共转录因子数据库预测结果交叉比对，优先确定BRG1为最可能的COL16A1调控因子。

ChIP-qPCR及双荧光素酶报告实验结果提示BRG1直接结合至COL16A1的启动子区域并激活COL16A1转录。WB显示DFU组织中BRG1蛋白水平较正常组织显著下调，糖尿病小鼠模型创面边缘BRG1表达也低于正常小鼠，体外高糖培养的成纤维细胞中BRG1表达同样受抑。这些观察促使研究团队假设：高血糖诱导的BRG1缺乏破坏了COL16A1的转录激活，从而损害创面修复过程。

接着通过腺病毒过表达和siRNA敲低进行验证：高糖条件下BRG1过表达显著恢复成纤维细胞增殖能力、增强迁移、改善收缩功能，同时上调COL16A1表达并促进COL1A1和COL3A1合成；反之，低糖环境中敲低BRG1抑制COL16A1表达，并重现高糖诱导的功能缺陷，包括增殖受损、迁移障碍、收缩功能减弱和胶原产生减少。

这些数据共同确立BRG1作为COL16A1的关键转录调控因子，协调成纤维细胞介导的ECM重塑，对糖尿病创面愈合至关重要。

BRG1恢复成纤维细胞介导的COL16A1分泌并促进小鼠糖尿病创面愈合

为探究BRG1在糖尿病创面愈合中的治疗潜力，研究团队在糖尿病小鼠背侧皮肤进行局部腺病毒介导的BRG1过表达。

创面愈合结果显示，BRG1过表达的糖尿病小鼠较未治疗糖尿病对照创面闭合速度显著加快。H&E和马松染色组织病理学评估显示，BRG1过表达组创面床收缩明显、再上皮化加速、胶原沉积增强。

基于BRG1体外结合COL16A1启动子的证据，研究团队进一步评估体内COL16A1表达。分析显示BRG1过表达后创面边缘COL16A1蛋白显著上调，且COL16A1与成纤维细胞标志物波形蛋白存在部分共定位。这些发现证明糖尿病皮肤局部BRG1过表达可恢复成纤维细胞介导的COL16A1分泌、促进创面床收缩并加速愈合动力学，表明 BRG1驱动的COL16A1转录激活导致糖尿病创面修复的功能改善。

BRG1的促纤维化效应依赖于COL16A1

为进一步确认BRG1的促纤维化效应是否依赖于COL16A1，研究团队进行了互补的体外挽救实验。

低糖条件下敲低BRG1的原代成纤维细胞表现出与前一致的生物功能受损（增殖、迁移和收缩能力）。随后在BRG1敲低细胞中过表达COL16A1显著挽救功能缺陷并恢复胶原合成，提示外源性COL16A1过表达可抵消BRG1敲低的抗纤维化效应。

反之，高糖条件下BRG1过表达的成纤维细胞在敲低COL16A1后表现出激活标志物减弱、增殖能力降低、迁移受损和收缩功能减少，表明COL16A1抑制可阻断BRG1的促纤维化效应。这些结果确凿证明 BRG1-COL16A1轴对于调控成纤维细胞功能至关重要。

研究结论

本研究系统解析了成纤维细胞来源的COL16A1在DFU创面愈合中的关键调控作用，并首次报道BRG1通过直接结合COL16A1启动子区域激活其转录，从而增强成纤维细胞功能和糖尿病创面修复，为开发针对慢性糖尿病创面的基因治疗策略提供了新的理论依据和分子靶标。

未来研究可进一步探索COL16A1调控成纤维细胞功能的具体机制，以及开发成纤维细胞特异性靶向递送系统，以实现创面床成纤维细胞的精准基因调控。

原文引用

“Recombinant adenoviral vectors (Ad)encoding COL16A1, BRG1(SMARCA4), and empty vector controls (Ad-NC) were packaged by Genomeditech (Shanghai, China)."

“BRG1 overexpression plasmids were constructed using the pcDNA3.1 vector. A luciferase reporter containing the COL16A1 promoter (–2000 kb to +50 kb) was generated by subcloning PCR products into pGL3-Basic (Genomeditech, Shanghai, China). ”

“Forthe reporter assay, 293T cells were plated in 24-well plates 1 day before transfection. Following the instructions of the manufacturer, cells were transfected with the overexpression, reporter,and pRL-TK plasmid. After transfection, cells were lysed, and firefly/Renilla luciferase activities were measured using the Dual-Luciferase Reporter System (Genomeditech). "

来源：课题组供稿