GPCR无细胞表达与纳米盘筛选：72h获得功能性β1AR样品

摘要：
本文围绕GPCR无细胞表达与纳米盘筛选方法，介绍在72小时内获得功能性β1AR样品的实验流程与结果，探讨该策略在膜蛋白制备和药物靶点研究中的应用价值。

关键词：
G蛋白偶联受体、GPCR、纳米盘、膜蛋白、无细胞蛋白合成、无细胞蛋白表达、β1AR、药物靶点研究

G蛋白偶联受体（GPCR）是35%获批药物的靶点，但已解析结构的受体数量仍然较少，主要难点在于传统去垢剂体系难以获得稳定且具有功能的样品。去垢剂会剥离保护性脂质，导致蛋白聚集、配体结合能力下降，往往需要数周反复优化才能满足实验需求。

无细胞蛋白合成（CFPS）技术可有效缓解这一问题，能够避免细胞毒性并实现膜蛋白共翻译整合。在体系中加入预组装的脂质纳米盘后，新合成的GPCR可直接插入近天然的脂双层环境中。这种无需去垢剂、“合成即稳定”的策略有助于保留关键的脂质-蛋白相互作用，并支持对可调控设计参数（支架尺寸、脂质组成）进行快速筛选优化，从而提升蛋白表达量与功能性折叠效率。

图1. 无细胞蛋白合成体系可在翻译过程中实现GPCR向特定脂质环境的共翻译插入。

相关无细胞GPCR纳米盘筛选体系通过优化膜支架蛋白尺寸与脂质组分，结合自动化数字微流控快速平行筛选，可在较短时间内确定GPCR适合的表达条件并获得可直接用于实验的活性蛋白。

图2. 无细胞蛋白表达筛选系统工作流程。

本应用展示了一套快速制备高活性热稳定截短型火鸡 β1 肾上腺素能受体（ttsΔβ1AR）的实验流程。借助微流控无细胞蛋白表达技术，高通量筛选并确定了适宜的脂质组成方案，相较于通用脂质体系可使受体的功能性配体结合活性提升3倍。目标受体放大表达后，通过尺寸排阻色谱（SEC）精制将活性单体比例富集至约45%，从而在72小时内获得可满足结构解析要求的高纯度 ttsΔβ1AR。

一、GPCR无细胞筛选β1AR制备方法

1. 序列设计与DNA制备

人源全长β1肾上腺素能受体（hβ1AR）、人源全长热稳定型β1肾上腺素能受体（htsβ1AR）及热稳定截短型火鸡β1肾上腺素能受体（ttsΔβ1AR）的表达构建体均基于前期研究进行设计。分别在受体序列的N端与C端引入3C酶切位点与TEV酶切位点接头序列，随后通过相关组装体系将目标序列构建为适配无细胞表达平台的线性DNA模板。

2. 无细胞蛋白表达筛选

采用相关无细胞表达平台及微流控芯片，对3种β1AR变体与8组无细胞反应体系进行自动化多重筛选。每种体系包含无细胞表达试剂、PDI/GSSG氧化还原混合液，以及预组装纳米盘或缓冲液对照。共测试7种纳米盘：其中4种来自GPCR纳米盘筛选体系，3种为通用型纳米盘（表1）。其余表达与纯化步骤使用配套膜蛋白表达与纯化体系完成。

表1. 用于多重筛选的8组无细胞反应体系。

3. 放大表达

参照优化方案进行放大表达。用于初步LAC分析时，构建含DNA构建体、无细胞表达试剂、PDI/GSSG以及MSP1E3D1纳米盘等的反应体系，29℃过夜孵育，经链霉亲和素磁珠纯化后，对粗产物和洗脱液进行SDS-PAGE分析；用于制备型SEC时，构建3 mL反应体系并分为1 mL等分孵育，加入RNase A处理后纯化、合并洗脱液并浓缩，蛋白产量采用相关定量试剂盒测定。

4. 制备型SEC与SE-UHPLC

将浓缩的ttsΔβ1AR放大样品上样至经SEC运行缓冲液预平衡的Superdex 200 Increase 10/300凝胶过滤柱，收集各峰组分并浓缩至约50 μL，速冻后于-80℃保存。

采用Waters ACQUITY Premier系统对SEC组分进行分析型SE-UHPLC验证。取10 μL过滤样品上样至蛋白SEC色谱柱，柱温25℃、样品室4℃；以含磷酸氢二钠、NaCl和精氨酸的缓冲液（pH 7.5）为流动相，0.4 mL/min流速运行8 min，通过色氨酸荧光检测蛋白洗脱。

5. 配体亲和层析

取7.5 μg纯化的ttsΔβ1AR，与20 μL预平衡的琼脂糖树脂于微型离心柱中4℃孵育2小时。

用洗涤缓冲液洗涤树脂3次，加入含异丙肾上腺素的洗脱缓冲液室温孵育2小时后离心洗脱活性受体。采用相关定量试剂盒测定蛋白浓度，并通过比较层析前后蛋白量计算结合率。

二、GPCR无细胞筛选β1AR实验结果

1. 24小时高通量筛选降低GPCR制备风险

使用无细胞蛋白表达筛选系统，可在24小时内完成3种β1AR变体在8组无细胞混合体系中的表达与纯化产量分析。该步骤可快速确定能有效表达蛋白的载体与条件组合，降低GPCR制备流程风险。如图3所示，带负电的纳米盘（DOPG、DMPG）在所有β1AR变体中均获得较大纯化产量。其中ttsΔβ1AR变体纯化浓度可达约5 μM，因此被选用于放大制备与功能表征。

图3. 无细胞蛋白表达筛选结果。

2. 从筛选到放大：纯化ttsΔβ1AR浓度约100μg/mL

在6种筛选出的纳米盘条件下对ttsΔβ1AR进行过夜放大表达，可成功获得约100 μg/mL的纯化受体。与筛选结果一致，MSP1E3D1-DOPG和MSP1E3D1-DMPG纳米盘组总蛋白产量较高（图4A）。SDS-PAGE结果证实ttsΔβ1AR在目标分子量处成功表达（图4B）。

图4. ttsΔβ1AR放大制备结果。(A) ttsΔβ1AR在6种不同MSP-脂质组分体系中的放大纯化产量；(B) ttsΔβ1AR在3种体系中放大表达后的电泳图。

3. GPCR纳米盘条件使受体活性提升3倍

无细胞表达筛选系统可预测蛋白产量并指导放大，但产量高并不等于受体具有功能，而脂质组成对GPCR活性构象影响较大。研究通过配体亲和层析（LAC）测定放大后样品的结合率（图5A）。结果表明，受体功能明显依赖脂质类型，GPCR纳米盘条件表现更优。在DOPG、POPC/POPS、POPC/POPS/胆固醇体系中，ttsΔβ1AR的功能结合率是DMPG体系的3倍（图5B），而POPC体系表达的ttsΔβ1AR无活性。

图5. 配体结合初步研究。(A) 配体亲和层析（LAC）示意图；(B) ttsΔβ1AR在6种不同MSP-脂质组分中的结合率。

相关GPCR专用纳米盘体系通过脂质组分优化，为受体提供了更适合的近天然膜环境，从而提升了β1AR活性，相较于饱和脂质或纯中性脂质体系表现更佳。

4. SEC精制将单体配体结合活性组分富集至45%

选用活性与产量较优的DOPG体系表达的ttsΔβ1AR进行制备型SEC精制，分离去除聚集体与错误组装蛋白，得到单体目标复合物；经检测，峰3活性结合率达45%，较初始纯化提升3倍，可用于后续结构和功能研究。

图6. ttsΔβ1AR样品质量富集。(A) MSP1E3D1-DOPG体系表达产物的SEC图谱；(B) 各SEC组分的分析型SE-UHPLC结果；(C) LAC结合分析显示峰3活性组分提升3倍。

三、无细胞筛选在GPCR制备中的应用总结

相关无细胞表达系统的工作流程将膜蛋白迭代优化周期从数月缩短至数天。采用快速自动化无细胞蛋白表达筛选，替代了耗时的细胞宿主构建和去垢剂筛选，可在72小时内获得活性GPCR蛋白。

该体系能够高通量筛选DNA构建体与纳米盘组合，快速确定高产优质条件；相较普通脂质配方，其功能配体结合活性可提升3倍。这种自动化筛选与近天然纳米盘体系，为结构生物学和药物靶点发现提供了相对稳定的高质量受体样品制备方案。

技术资料说明

本文基于GPCR、膜蛋白、无细胞蛋白合成、无细胞蛋白表达技术应用、文献等公开技术资料整理，用于科研信息交流。