深度解读：人原代肝细胞白皮书核心要点

本文摘要：
本文围绕人原代肝细胞的生理特性、应用场景、制备质控与分型展开梳理，结合公开资料总结其在药物研发与ADMET研究中的应用价值，为体外模型选择提供参考。

一、人原代肝细胞核心生理特性

1.1 肝细胞基础生理特征

在健康成人肝脏中，肝细胞占肝脏总体积的80%、细胞总数的60%，为高度极化的上皮细胞，可执行肝脏核心生化与生理功能，包括合成白蛋白、中甲状腺素结合球蛋白等血液结合/载体蛋白，以及合成外源性物质摄取、代谢、外排相关的代谢酶与转运蛋白。

1.2 肝小叶分区的功能差异性

肝小叶可分为门静脉周围区（1区）、小叶中区（2区）、中心周围区（3区），因微血管分布、血流定向性形成的自然梯度与微环境，导致不同区域肝细胞的基因表达、表型及功能存在明显差异：

• ·1区肝细胞的脂肪酸β-氧化、胆固醇代谢能力及PPAR调节基因表达更为突出；

• ·2区为中间过渡带，功能为1区和3区的混合；3区肝细胞的胆汁酸、脂肪生成及谷氨酰胺合成酶代谢能力更强，且参与外源物生物转化的多数细胞色素P450（CYP）酶在此区域表达水平更高；

• ·3区肝细胞同时高表达OATP1B1、OATP1B3等摄取转运蛋白与CYP蛋白，具备完善的外源物蓄积与代谢能力，也更易受CYP介导的活性代谢物相关毒性影响；

• ·不同肝小叶区域对肝毒性物质的反应存在特异性，如对乙酰氨基酚易引发3区毒性，烯丙醇、磷则易导致1区特异性损伤。

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图1. 肝小叶分区图（PV: Portal Vein 肝门静脉；CV: Central Vein 中央静脉）。注：图示来源 LifeNet Health 官方 Webinars。

二、人原代肝细胞在 ADMET 领域的核心应用

人原代肝细胞构建的体外模型是评估新化学物质代谢、酶诱导潜力的重要参考模型，在药物研发的ADMET（吸收、分布、代谢、排泄、毒性）研究中具有较高应用价值，不同培养体系的适配场景如下：

• 悬浮培养体系 ：可用于评估化合物体内药代动力学及清除率，是药物发现早期阶段研究代谢稳定性与代谢途径的常用方法；

• 三明治培养（SC）体系 ：可评估化合物通过诱导或抑制肝酶引发的不良反应风险，同时研究药物摄取、外排转运体功能，预测化合物的胆汁分泌及代谢产物生成；

• 三维（3D）球体培养体系 ：可提升体外模型的生理相关性，维持肝细胞较高代谢稳定性并实现长期体外培养，有助于提升药物性肝损伤（DILI）预测的准确性；

• 长效代谢稳定培养体系 ：适用于低代谢率药物的长期清除过程研究，同时为药物代谢、转运及DILI的体外研究提供更贴合体内生理状态的实验模型。

此外，人原代肝细胞体外模型还可用于候选药物肝毒理机制的快速筛选，评估活性代谢产物的蛋白质加合、线粒体功能紊乱、外排转运蛋白抑制等DILI关键诱因。在补充胆汁酸的条件下，相关检测结果与临床结果的一致性也可进一步提升。

三、人原代肝细胞分离制备技术

3.1 传统肝细胞分离方法及其局限性

目前人原代肝细胞的分离多基于经典两步法，依赖粗制胶原酶与非特异性蛋白酶制剂，并普遍采用Percoll密度梯度离心富集。由于所得细胞批次可能混有不同比例的肝小叶分区亚群及非实质细胞（NPCs），因而容易出现组成与表型差异，影响实验重复性。

3.2 肝细胞制备技术优化点

公开资料显示，相关人原代肝细胞在标准化采集条件下制备，核心优化点主要包括：

• 从组织采集到实验室转运全程采用增强型组织灌流与保存技术，尽可能缩短热缺血和冷缺血时间；

• 将长期临床产品生产与质控体系延伸至临床前组织与细胞产品，建立更高标准的采集与监测体系，从而提升组织处理成功率及肝细胞制备质量。

四、冻存人原代肝细胞包含哪些质控项目

每批次冻存人原代肝细胞均可配备全面的质检报告（CoA），并经过多维度功能与质量表征。相关质控体系通常覆盖人口统计学、病理检测、基因分型、酶活性检测等多个层面，核心项目如下：

• 基础信息与病理检测 ：包含捐赠者人口统计学数据、血液生化指标、BMI指数、药物/酒精/烟草接触史、血清学检测结果；组织样本可经病理学家进行NAFLD活动度评分，相关资料中可附组织病理学评分及H&E、三色染色图像；

图2. 脂肪肝组织病理学图像（三色染色），白色箭头指示脂滴。

• 药理基因分型 ：完成与候选药物代谢直接相关的I相、II相酶基因分型，包含测序结果、参考等位基因及多个单核苷酸多态性（SNP）的等位基因频率，并可按捐赠者种族进行分析，将个体分为弱代谢型、中间代谢型、强（正常）代谢型；

• 细胞基础特性检测 ：确定细胞复苏后的平均存活率、产量、形态完整性、贴壁效率，明确适配的培养类型；贴壁型批次可标注接种密度，并附单层细胞培养代表性图像；

• CYP酶活性检测 ：使用阳性选择性底物测定CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C8、CYP2C19、CYP3A4等酶活性；并评估7-乙氧基香豆素、7-羟基香豆素经I相、II相代谢酶生成代谢产物及结合物的能力；

• 酶诱导响应检测 ：中长期贴壁肝细胞经48/72小时诱导处理后，检测CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4对原型诱导剂的响应，并记录mRNA表达倍数及特异性酶活性数据。

五、为什么选择冻存人原代肝细胞？其分型可用于哪些应用场景

完成复苏检测后，冻存人原代肝细胞可按应用场景进行标准化分类，不同分型均经过多维度质控，并配套对应检测数据与图像。常见分型及适配场景如下：

5.1 成人悬浮型/短期贴壁型

• 核心应用 ：用于新药研发早期评估新化合物的代谢稳定性、代谢途径，推算生物利用度、半衰期等药代动力学参数，是该研究场景中的常用材料；

• 质控特点 ：经CYP酶活性检测及代谢能力评估，配套复苏存活率、单支产量及对应培养条件下的代表性图像。

图3. 成人原代肝细胞，复苏后（明场）。

5.2 成人中期/长期贴壁型

• 核心应用 ：用于评估体内药物相互作用潜在风险，检测新化学实体（NCE）对I/II相代谢酶、摄取/外排清除机制的上调作用；适配三维（3D）球体培养体系，支撑低代谢率药物的长期清除过程研究；

• 质控特点 ：完成典型核受体通路阳性诱导剂测试，提供48/72小时诱导后的mRNA表达及酶活性数据；同时附推荐接种密度及不同贴壁时长下的代表性图像；所有批次保证至少1周稳定培养，并满足相应诱导性能要求。

图4. 成人原代肝细胞贴壁图像。上图：a) 贴壁120h单层培养图像；下图：b) 贴壁240h单层培养图像。

5.3 成人高BMI/NAFLD/NASH型

• 核心应用 ：用于研究NAFLD/NASH疾病状态下药物代谢酶（DMEs）与转运蛋白表达变化，探索肝病相关药物代谢、清除与毒理机制，并评估药物在肝病模型中的安全性与有效性；

• 质控特点 ：涵盖脂肪变性、NASH、肝细胞癌（HCC）等不同阶段的NAFLD捐赠者肝细胞，经病理学家进行组织病理学评价，并附病理图像与评分。

5.4 新生儿/儿童/青少年型

• 核心应用 ：用于研究药物代谢及清除机制的年龄依赖性差异，探究不同年龄段的肝毒性潜在风险，为儿科药物研发提供更贴合生理状态的实验模型；

• 质控特点 ：覆盖新生儿、儿童、青少年全年龄段，配套CYP酶活性及代谢能力检测数据，并包含捐赠者信息、复苏数据、推荐接种密度及代表性图像。

注： 各分型均可提供悬浮型和贴壁型两种形式，以满足不同培养体系需求。

六、总结

人原代肝细胞依托标准化组织采集与制备技术，在一定程度上改善了传统分离方法导致的细胞表型不均问题，同时建立了覆盖病理、基因、酶活性和诱导响应的多维度质控体系。每批次产品均可配备较完整的CoA和相关图像数据，有助于提高实验重复性和结果可靠性。

对于药物研发和ADMET研究而言，人原代肝细胞不仅是体外模型的重要组成部分，也在代谢研究、药物相互作用评估、DILI预测以及特殊人群药理研究中具有较高参考价值。

常见研究问题整理

1. 什么是人原代肝细胞？它的主要组成和核心价值是什么？

人原代肝细胞是从人肝脏组织中直接分离获取的原代肝细胞，可分为肝实质细胞和肝非实质细胞。其中肝实质细胞是最主要的组成部分，占肝脏体积约80%、细胞总数约60%，具备肝脏代谢、解毒和合成功能，是体外药物研究中的重要模型。

2. 肝小叶分区（1/2/3区）对肝细胞功能有何影响？

1区以脂肪酸氧化和胆固醇代谢能力更强为特征；2区为过渡区域；3区则以CYP450酶表达更高、外源物代谢更强、肝毒性敏感性更高为特点。

3. 为什么原代肝细胞比肝癌细胞系更可靠？

原代肝细胞能够较多保留完整的代谢酶、核受体、转运蛋白及生理调控通路，因此结果通常更接近体内状态；而细胞系由于基因和表型变化，往往存在代谢功能下降的问题。

4. 为什么需要新生儿/儿童肝细胞？

药物代谢酶和转运体会随年龄发育而变化，儿童与成人在药代和毒理反应上可能存在明显差异，因此相关模型可用于儿科药物研发与剂量设计研究。

5. 人肝细胞的供体来源是否需要合规背景？

需要。人原代肝细胞的供体来源、伦理审批、知情同意、传染病筛查和组织病理评估等，都是影响研究合规性的重要前提。

6. 冻存肝细胞复苏后如何判断质量是否合格？

通常可从细胞存活率、贴壁均匀性、细胞形态完整性和是否存在大量碎片等方面综合判断。一般来说，较好的复苏状态应表现为较高存活率、贴壁均匀且细胞结构完整。

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技术资料说明

本文基于LifeNet人原代肝细胞、CYP酶等应用、文献等公开资料整理，用于科研信息交流。