表面等离子体共振技术在生物分子相互作用研究中的应用

1 引言

表面等离子体共振技术是一种实时、无标记的光学生物传感技术，用于检测生物分子间的相互作用。该技术通过监测金属表面附近折射率的变化，实时追踪分子结合与解离过程，可提供结合动力学参数及亲和力信息。BIACORE是最早将SPR技术商业化并广泛应用于生命科学研究平台的名称，该术语已在一定程度上成为SPR生物传感技术的代名词。

SPR技术在分子免疫学、药物发现及疾病机制研究中具有广泛应用。通过实时监测抗体-抗原结合、受体-配体相互作用及蛋白质-小分子化合物结合，SPR技术为理解免疫识别、信号转导及疾病相关分子事件提供了关键实验数据。本文从技术原理层面阐述SPR的基本物理基础及检测流程，重点分析该技术在自身免疫性疾病生物标志物发现、肿瘤免疫治疗抗体筛选及感染性疾病病毒-受体相互作用研究中的应用，并探讨其在疾病诊断及治疗监测中的潜在价值。

2 表面等离子体共振技术的原理

2.1 物理基础

表面等离子体共振是一种发生于金属与电介质界面的物理光学现象。当偏振光以特定角度入射至金属薄膜表面时，可激发金属表面自由电子的集体振荡，形成表面等离子体波。表面等离子体共振发生的条件取决于入射光的波长、角度及金属表面附近介质的折射率。

当入射光的角度或波长满足表面等离子体共振条件时，入射光能量被耦合至表面等离子体波，反射光强度显著下降，在反射光谱上形成特征性的共振吸收峰。共振角度或波长对金属表面附近介质的折射率变化极为敏感。当生物分子结合至金属表面时，表面层折射率发生改变，导致共振角度或波长的偏移。通过实时监测这一偏移，可追踪分子间相互作用的动态过程。

2.2 传感器芯片与微流控系统

SPR技术的核心部件是传感器芯片，通常为镀有金膜的玻璃载玻片。金膜表面可偶联多种功能基团，用于固定配体分子。根据固定策略的不同，传感器芯片可分为多种类型。CM5芯片表面偶联羧甲基葡聚糖，可用于氨基偶联、巯基偶联及醛基偶联等多种固定方法。SA芯片表面预固定链霉亲和素，用于捕获生物素标记的配体。NTA芯片表面偶联氨三乙酸，用于捕获组氨酸标签融合蛋白。

微流控系统将缓冲液及样品精确输送至传感器芯片表面，实现样品的自动化注入及再生。微流控通道的设计使样品消耗量降至微升级别，同时可同时检测多个通道，实现高通量分析。

2.3 检测流程与关键参数

SPR检测的基本流程包括配体固定、分析物结合、解离及芯片再生四个步骤。配体固定是将待研究的一种分子共价或非共价偶联至传感器芯片表面。分析物结合是含待研究另一种分子的溶液流经芯片表面，分析物与固定化配体结合导致SPR信号升高。解离是切换为空白缓冲液流经芯片表面，分析物从配体上解离导致SPR信号下降。芯片再生使用低pH或高盐缓冲液洗脱残留结合分子，使芯片表面恢复至初始状态，用于下一轮检测。

SPR技术可提供多个关键参数。结合速率常数反映分子间结合的快慢，单位为M⁻¹·s⁻¹。解离速率常数反映复合物稳定性的高低，单位为s⁻¹。平衡解离常数是结合速率常数与解离速率常数的比值，反映分子间亲和力的大小。响应水平反映固定化配体与结合分析物的化学计量关系。通过分析不同浓度分析物的结合曲线，可拟合得到上述动力学及亲和力参数。

3 表面等离子体共振技术在自身免疫性疾病研究中的应用

3.1 自身抗体检测与表征

自身免疫性疾病的特征之一是患者血清中存在针对自身抗原的自身抗体。SPR技术可实时检测自身抗体与自身抗原的结合，提供抗体-抗原相互作用的动力学参数。

在系统性红斑狼疮研究中，SPR技术已用于检测抗dsDNA抗体与dsDNA的结合亲和力。通过将dsDNA固定于传感器芯片表面，流经稀释的患者血清，可定量检测抗dsDNA抗体的浓度及亲和力。抗dsDNA抗体的亲和力与狼疮肾炎的活动性及严重程度相关，高亲和力抗体患者发生肾脏受累的风险更高。

在类风湿关节炎研究中，SPR技术已用于检测抗环瓜氨酸肽抗体与瓜氨酸化抗原的结合。抗CCP抗体是RA高度特异的血清学标志物，其亲和力及结合动力学与疾病活动度及关节破坏程度相关。SPR技术还可用于检测类风湿因子与IgG Fc段的结合，分析RF的亲和力及亚型分布。

3.2 自身抗原的鉴定与验证

SPR技术可用于鉴定及验证自身免疫性疾病中的新型自身抗原。通过将患者血清中的自身抗体作为配体，从组织或细胞裂解液中捕获自身抗原，再通过质谱鉴定自身抗原的分子身份。SPR技术可用于验证候选自身抗原与患者自身抗体的特异性结合，排除非特异性交叉反应。

3.3 治疗性抗体的筛选与优化

SPR技术在自身免疫性疾病治疗性抗体的筛选与优化中发挥核心作用。通过SPR技术，可高通量筛选能够以高亲和力结合靶抗原的单克隆抗体，筛选具有理想动力学特征的候选抗体。理想的治疗性抗体通常需要较高的结合速率及较慢的解离速率，以实现持久的靶点占据。

SPR技术还可用于分析治疗性抗体与靶抗原结合的分子机制，通过竞争实验确定抗体识别的表位，指导抗体的工程化改造。

4 表面等离子体共振技术在肿瘤免疫治疗中的应用

4.1 免疫检查点抗体筛选

免疫检查点抑制剂是肿瘤免疫治疗的重要突破。SPR技术在免疫检查点抗体的筛选及优化中发挥关键作用。通过将PD-1或PD-L1固定于传感器芯片表面，流经候选抗体，可定量测定抗体与靶点的结合亲和力及动力学参数。高亲和力抗体通常具有更持久的靶点占据能力，但过高的亲和力可能导致组织穿透能力下降及靶外毒性增加。SPR技术可指导抗体亲和力的优化。

SPR技术还可用于分析免疫检查点抗体与Fc受体的结合。抗体的Fc段与FcγR的结合可介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，是清除靶细胞的关键机制。通过将FcγR固定于芯片表面，流经抗体-抗原复合物，可评估抗体介导ADCC效应的潜力。

4.2 CAR-T细胞靶点筛选

嵌合抗原受体T细胞治疗需要筛选能够高特异性识别肿瘤抗原的单链可变区片段。SPR技术可用于测定scFv与肿瘤抗原的结合亲和力及动力学参数。理想靶点scFv应具有适中的亲和力——过高的亲和力可能导致靶向非肿瘤组织的“靶上脱瘤”毒性，过低的亲和力则不足以有效激活T细胞。SPR技术还可用于分析scFv与正常组织表达的抗原同源物的交叉反应性，筛选具有高肿瘤特异性的scFv。

4.3 双特异性抗体的设计与优化

双特异性抗体可同时结合肿瘤细胞表面抗原及T细胞表面CD3分子，桥接T细胞与肿瘤细胞。SPR技术在双特异性抗体的设计与优化中具有独特优势。通过将两种抗原分别固定于不同通道，可同时测定双特异性抗体对两种靶点的亲和力。通过顺序流经两种抗原，可验证双特异性抗体是否能够同时结合两种靶点，即形成三元复合物。

5 表面等离子体共振技术在感染性疾病研究中的应用

5.1 病毒-受体相互作用研究

病毒感染宿主细胞的第一步是病毒表面蛋白与细胞表面受体的特异性结合。SPR技术可用于研究病毒表面蛋白与受体的相互作用动力学，揭示病毒感染的分子机制。

在人类免疫缺陷病毒研究中，SPR技术已用于分析gp120蛋白与CD4受体及趋化因子共受体的结合。通过将CD4固定于芯片表面，流经不同浓度的gp120，可测定两者结合的亲和力。通过竞争实验，可筛选能够阻断gp120-CD4结合的候选抗体或小分子化合物。

在新型冠状病毒研究中，SPR技术用于分析刺突蛋白及其受体结合域与血管紧张素转换酶2受体的结合。不同变异株刺突蛋白与ACE2的亲和力差异可解释变异株传播能力及免疫逃逸能力的变化。SPR技术还用于评估中和抗体及恢复期血清对刺突蛋白-ACE2结合的阻断能力。

5.2 中和抗体筛选与表征

SPR技术可高通量筛选具有病毒中和活性的抗体。通过将病毒表面蛋白固定于芯片表面，流经候选抗体，可测定抗体的结合亲和力。进一步通过竞争实验，可筛选能够阻断病毒表面蛋白与受体结合的抗体。SPR技术测定的抗体亲和力与体外中和活性通常呈正相关，可作为中和抗体筛选的重要参考。

SPR技术还可用于分析抗体的表位多样性。通过将一种抗体固定于芯片表面，使其饱和结合病毒表面蛋白，再流经第二种抗体。若第二种抗体仍可结合，说明两者识别不同表位；若无法结合，说明两者识别相同或空间重叠的表位。这一信息对于选择具有协同效应的抗体组合至关重要。

5.3 抗菌药物筛选

SPR技术同样可用于抗菌药物的筛选及机制研究。通过将细菌靶蛋白固定于芯片表面，流经候选化合物，可测定化合物与靶蛋白的结合亲和力。通过分析化合物与靶蛋白结合的动力学参数，可评估化合物作为酶抑制剂或受体拮抗剂的潜力。SPR技术还可用于研究抗生素与细菌核糖体、细胞壁合成酶及DNA复制酶等靶点的相互作用。

6 表面等离子体共振技术的局限性与发展方向

SPR技术的主要优势包括实时监测、无标记检测、低样品消耗及高信息含量。但其局限性同样值得关注。SPR技术无法提供分子相互作用的原子分辨率结构信息，需结合X射线晶体学、核磁共振或冷冻电镜等结构生物学技术。SPR技术对样品纯度要求较高，粗提物或血清中的非特异性结合可能干扰分析结果。SPR技术的通量虽较早期有所提高，但与ELISA等终点检测方法相比仍有一定差距。

当前SPR技术的发展方向包括高通量SPR成像、微型化及便携式SPR设备、与质谱联用的SPR-MS技术及基于SPR的单分子检测技术。这些进展将进一步拓展SPR技术在生物医学研究及临床诊断中的应用。

7 总结

表面等离子体共振技术是一种实时、无标记的光学生物传感技术，通过监测金属表面折射率的变化，追踪生物分子间相互作用的动态过程。SPR技术可提供结合速率常数、解离速率常数及平衡解离常数等关键动力学参数，在分子免疫学、药物发现及疾病机制研究中具有广泛应用。在自身免疫性疾病研究中，SPR技术用于自身抗体检测、自身抗原鉴定及治疗性抗体筛选；在肿瘤免疫治疗中，SPR技术用于免疫检查点抗体筛选、CAR-T靶点筛选及双特异性抗体优化；在感染性疾病研究中，SPR技术用于病毒-受体相互作用研究、中和抗体筛选及抗菌药物筛选。深入理解SPR技术的原理及其在疾病相关生物分子相互作用研究中的应用，可为生物医学研究及临床诊断策略的优化提供理论参考。