嵌合CD3ζ-CD28可增强抗原特异性IL-2分泌并促进扩增

含CD28信号基序的嵌合CD3ζ链可增强抗原特异性IL-2分泌并促进人TCR-T细胞在体外的扩增

基因工程改造的T细胞产品已用于癌症免疫治疗，对血液系统恶性肿瘤疗效显著，但在实体瘤治疗中效果有限。TCR工程化T细胞利用经改造后靶向MHC分子呈递的肿瘤相关肽或肿瘤特异性肽的TCR。CD3ζ链是T细胞表面TCR-CD3复合物的组成部分，在TCR与MHC呈递的肽结合时介导信号转导。这里，伦敦大学学院Hans J. Stauss、Emma C. Morris等教授，探讨了在CAR-T细胞中被证实可增强T细胞功能的共刺激结构域，是否同样可用于提升TCR-T细胞的功能。分别将CD28或4-1BB的信号结构域插入CD3ζ胞内段靠近细胞膜端或远离细胞膜端，并构建表达特异性TCR的人源T细胞，使其同时表达经修饰的CD3ζ或未修饰的对照CD3ζ。抗原特异性体外刺激实验显示，表达含CD28信号结构域CD3ζ的T细胞，其肽段特异性IL-2分泌能力增强；经多次抗原刺激后，扩增数量亦显著高于表达未修饰CD3ζ的T细胞。尤为重要的是，含CD28的CD3ζ所促进的更强扩增并未导致效应功能下降——以肽段特异性杀伤活性及细胞因子分泌能力评估均未见降低。上述结果表明，通过在CD3ζ链中引入CD28信号基序，可在单一分子TCR-CD3复合物中整合第一信号（Signal 1）与共刺激第二信号（Signal 2），从而提升TCR工程化T细胞的抗原特异性扩增能力与效应功能。

与血液系统恶性肿瘤不同，实体瘤常伴有高度免疫抑制性的肿瘤微环境。缺氧、营养匮乏以及免疫抑制性细胞与细胞因子的存在，均会削弱T细胞在肿瘤微环境中的功能，并加速其耗竭。在实体瘤治疗中，相较于仅能靶向细胞表面抗原的CAR-T细胞，TCR-T细胞能够通过MHC呈递的多肽，靶向更广泛的胞内及细胞表面抗原，因而展现出令人振奋的应用前景。与CAR-T细胞相比，TCR-T细胞激活所需表位密度更低，这一优势尤为突出，因为肿瘤细胞可能在治疗压力下下调靶抗原表达，从而发生抗原逃逸现象。

自然情况下，T细胞通过其TCR被激活，这一过程发生于TCR与靶细胞表面的pMHC复合物结合时。TCR信号复合体由六种不同分子组成：TCRα链、TCRβ链、CD3ε、CD3δ、CD3γ和CD3ζ。TCR复合体中含有两个CD3ζ分子，它们通过名为ITAM的结构域启动TCR下游信号传导。在TCR与pMHC结合后，LCK对ITAM进行磷酸化，从而招募ZAP70；后者继而活化LAT，并进一步触发下游信号通路，最终导致T细胞活化。每个CD3ζ含有三个ITAM，这些ITAM是TCR的主要信号元件，也是将其作为CAR构建中关键组分的理论依据。TCR信号受TCR亲和力（affinity）、TCR与pMHC相互作用的强度，以及由T细胞表面TCR分子密度所决定的TCR亲合力（avidity）调控。T细胞反应的输出指标为功能性亲合力，即在递减浓度肽段刺激下所测得的抗原特异性T细胞反应。

T细胞的最佳活化需要TCR介导的信号（Signal 1）与额外的共刺激信号（Signal 2）协同作用。常见的共刺激分子包括CD28、CD137（又称41BB或TNFRSF9）以及OX-40。CD28可与APC表面的CD80/86结合，从而触发其信号结构域SH2和SH3的磷酸化；继而激活下游转录因子NFκB、NFAT和AP-1，并启动PI3K信号通路。这些分子及其相应信号通路的活化主要促进IL-2分泌增加，同时也增强T细胞增殖并抑制凋亡。CD137属于TNFR超家族，可与APC表面的CD137L结合，通过TRAF1和TRAF2介导下游信号传导。该通路可促进T细胞存活与扩增，并提高IFNγ的产生。

为克服TCR-T细胞疗法所面临的挑战，借鉴了CAR-T细胞的研究经验，赋予TCR在与MHC结合后同时传递第一信号和第二信号的能力。通过引入这一额外的信号结构域，旨在提升经改造TCR-T细胞的功能表现，促进其分泌更多细胞因子并增强杀伤效力。为此，通过将共刺激分子CD28和CD137的信号结构域引入CD3ζ链，构建了经修饰的CD3ζ链。研究发现，在CD3ζ中加入CD28信号结构域，可增强TCR基因工程化T细胞的抗原特异性增殖能力及IL-2分泌水平，同时保留其抗原特异性的细胞毒功能。

含CD28信号结构域的CD3ζ可增强人Jurkat T细胞的抗原特异性IL-2分泌

检测了在CD3ζ胞质区尾部引入CD28或CD137信号基序是否可提升TCR–CD3复合物的功能。构建了多种CD3ζ构建体，将CD28或CD137信号结构域分别插入ζ链胞内尾部天然三个ITAM基序的近端或远端位置（图1a）。此外，还构建了一种CD3ζ构建体，其“天然”ITAM基序发生重复，最终形成共含6个ITAM的结构（图1a）。所有CD3ζ构建体均被克隆至含mCherry的慢病毒载体中，mCherry作为标记用于识别转导成功的细胞（图1b）。

采用人源Jurkat 76 T细胞，该细胞内源性表达CD3亚基但不表达TCR，并通过携带CD19作为转导标记物的载体，导入针对人CMV肽段表位的特异性TCR的α/β链（图1b）。在CD19阳性Jurkat细胞中，超过90%的细胞高水平表达所导入的TCR，并与CD3复合物共同表达，这一现象通过抗CD3ε抗体染色得以证实（图1c，左图）。利用CRISPR-Cas9技术敲除这些Jurkat细胞中的内源性CD3ζ基因，导致79.9%的细胞丧失TCR及CD3表达（图1c，中图）。再经流式细胞分选，获得一株Jurkat细胞系，其中超过98%的细胞表面缺失TCR/CD3（图1c，右图）。基因测序证实，CRISPR成功靶向内源性CD3ζ基因，在其第1外显子中插入碱基对，造成开放阅读框移码（图1d）。随后，利用这些细胞检测CD3ζ构建体能否恢复TCR/CD3复合物的表面表达，以及是否影响抗原特异性TCR功能。

图1 含CD28信号基序的CD3ζ可在CD3ζ基因敲除后恢复TCR表达，并增强细胞活化及IL-2分泌。

图1e、f显示，所有CD3ζ构建体均能恢复转导Jurkat细胞中TCR/CD3的表达；这些细胞经分选，确保其mCherry+与CD19+表达水平一致。然而，未修饰的野生型CD3ζ及含6个ITAM基序的构建体转导后，细胞表面TCR/CD3表达水平最高。相比之下，含CD28或CD137信号基序的CD3ζ在细胞表面表达的TCR/CD3显著降低，提示这些基序的存在削弱了CD3ζ链的稳定性及/或其高效组装为TCR/CD3复合物的能力。本实验中，以内源性CD3ζ基因完整的Jurkat细胞作为表面TCR/CD3表达的对照。

使用TCR识别的CMV肽（NLV）进行刺激的结果显示，野生型CD3ζ及所有构建体在10μM和1μM同源肽（NLV）刺激后均能介导CD69上调，但在无关对照肽（CTRL）刺激后则无此效应。尽管各构建体诱导的肽特异性CD69上调水平相近，但均显著高于仅表达内源性CD3ζ的细胞（图1g）。在检测细胞分泌IL-2的能力时，观察到不同CD3ζ构建体之间存在明显差异（图1h）。在所有肽浓度下，转导含CD28结构域构建体的细胞所分泌的IL-2量至少为内源性CD3ζ细胞的两倍（图1h）。而CD28构建体转导细胞的TCR表达水平低于内源性CD3ζ细胞（图1f），表明抗原特异性的IL-2反应增强并非源于转导Jurkat细胞TCR亲和力的提升。与表达内源性CD3ζ的Jurkat细胞相比，转导野生型CD3ζ或含6个ITAM的构建体的细胞IL-2分泌亦有所改善（图1h）；但在此情况下，IL-2分泌量翻倍与TCR表达水平翻倍相一致（图1f），提示转导Jurkat细胞TCR亲和力升高导致了IL-2分泌增强。而含CD137信号基序的CD3ζ构建体转导细胞IL-2分泌减少，且其TCR表达水平亦低于内源性CD3ζ Jurkat细胞，表明CD137基序与CD28不同，无法挽救“低TCR表达”细胞的IL-2产生能力。

接下来，探讨了在内源性CD3ζ链表达的情况下，含CD28信号基序的CD3ζ是否仍能介导IL-2分泌的增强。为此，将所有CD3ζ构建体分别转导至表达CMV TCR并具有内源性CD3ζ的Jurkat细胞中。结果发现，额外转导未修饰的CD3ζ或含6个ITAM的CD3ζ，可使细胞表面TCR表达量提高约三倍（图2a–c）。相比之下，转导含CD28或CD137结构域的构建体，并未显著提升Jurkat细胞表面TCR的表达水平（图2a–c）。

使用10μM和1μM同源CMV肽刺激后，所有受试细胞中CD69上调水平相似，且不受信号基序影响（图2d）。然而，与之前结果一致，抗原特异性IL-2分泌量存在显著差异：在所有测试的肽浓度下，转导含CD28信号基序的CD3ζ的细胞所分泌的IL-2均高于其他所有细胞（图2e）。值得注意的是，含CD28信号基序且该基序位于膜远端位置的CD3ζ构建体所诱导的IL-2分泌量最高；而CD28基序位于膜近端位置的构建体则介导了更高的TCR细胞表面表达水平（图2c、e）。这表明，CD28信号结构域位于膜远端时，在促进抗原特异性IL-2分泌方面更为有效。

图2 CD3ζKO并非CD3ζ修饰产生功能性反应所必需。

综上所述，Jurkat细胞中的实验结果表明，所有经测试的CD3ζ构建体均能组装成CD3复合物，并支持TCR在细胞表面表达。所有构建体在介导抗原特异性CD69上调方面效率相当；然而，含有CD28信号基序的CD3ζ构建体在介导抗原特异性IL-2分泌方面表现更优。最后，在表达内源性CD3ζ的细胞中，同样观察到含CD28信号基序的CD3ζ可增强IL-2分泌，这表明无需敲除CD3ζ基因即可获得CD28修饰型CD3ζ链所带来的益处。

含CD3ζ并带有CD28信号基序的结构可增强原代人T细胞中抗原特异性IL-2和TNFα的产生

在Jurkat细胞中观察到含CD28基序的CD3ζ功能增强后，进一步在表达内源性CD3ζ的原代人T细胞中检测了CD28修饰的效果。T细胞自白膜层分离，并分别转导CMV-TCR联合野生型CD3ζ或含CD28信号基序的CD3ζ。通过流式细胞术对CD19（存在于TCR构建体中）与mCherry（存在于CD3ζ构建体中）双阳性细胞进行设门，鉴定成功转导的T细胞（图3a）。随后每周以TCR识别的CMV肽NLV刺激细胞，持续3–4周，以评估转导T细胞的扩增能力及表型变化。

野生型CD3ζ及两种CD28构建体均能提高人T细胞的TCR表达水平（图3a、b）。与仅转导CMV-TCR的T细胞相比，同时转导野生型CD3ζ可使TCR表达量提升三倍，而同时转导含CD28的ζ链则使TCR表达量提升两倍（图3b）。

采用胞内细胞因子检测法（ICS）分析新鲜转导的T细胞在第0天，以及使用TCR识别的多肽进行每周扩增后第7天和第14天的抗原特异性应答。图3c、d展示了新鲜转导T细胞经相应CMV多肽（NLV）或无关对照多肽过夜刺激后，具有代表性的IL-2、TNFα和IFNγ产生情况，表明所有转导的T细胞群体均能产生多肽特异性的细胞因子。然而，转导野生型CD3ζ的T细胞表现出高水平的非特异性IL-2分泌，这可能源于高TCR表达水平所引发的持续性信号（图3c）。图3d汇总了新鲜转导T细胞在第0天及体外扩增7天和14天后抗原特异性IL-2的产生量（已扣除非特异性应答）。在所有时间点上，共转导CMV-TCR与含CD28基序CD3ζ构建体的T细胞展现出最强的多肽特异性IL-2应答（图3c）。同样，在体外扩增7天和14天后，含CD28基序的CD3ζ构建体在诱导抗原特异性TNFα产生方面效果最为显著（图3d）。T细胞活化程度通过CD69表达水平进行分析，但未观察到明显差异。

还分析了同时产生IL-2、TNFα和IFNγ的多功能T细胞所占百分比。在针对特异性肽段刺激时，各类CD3ζ构建体在单因子、双因子或三因子分泌细胞的百分比上均未观察到显著差异（图3e）。

图3 CD28修饰的CD3ζ原代CD3+ T细胞提高了抗原特异性IL-2和TNFα分泌细胞的比例。

含CD28信号基序的CD3ζ可增强体外抗原特异性T细胞扩增

采用流式细胞术分析新转导的T细胞，以确定CD19⁺ mCherry⁺转导细胞所占百分比及绝对数量（图4a）。随后，在第0、7、14和21天，以固定数量的CD19⁺ mCherry⁺细胞为起始，用CMV肽进行刺激。每次刺激后，测定细胞总数，并计算CD19⁺ mCherry⁺ T细胞所占百分比（图4a）及其扩增倍数（图4b），从而获得基于初始细胞群的扩增动力学数据。与内源性CD3ζ或额外添加野生型CD3ζ的T细胞相比，转导了含CD28的CMV-TCR及CD3ζ的T细胞在每轮刺激后，其百分比和扩增倍数均显著升高（图4a、b）。体外刺激21天后，含CD28的CD3ζ可轻微降低细胞耗竭标志物的表达水平。

图4 CD28修饰的CD3ζ在持续多肽刺激过程中增强T细胞扩增。

每轮多肽刺激结束后，均采用负载相关多肽（NLV；CFSC-low）或对照多肽（CTRL；CFSC-high）的T2靶细胞进行体外细胞毒性检测。经 overnight 孵育后，分析CFSC-low与CFSC-high T2细胞的比例（图5a）。在所有检测时间点均能检测到抗原特异性靶细胞杀伤效应，其中第14天的杀伤效果最为显著（图5b–d）。尤为重要的是，转导含CD28构建体的T细胞仍保持高效的靶细胞杀伤能力，表明这些细胞的高扩增并未削弱其细胞毒性活性（图5b–d）。

图5 CD28修饰的CD3ζ在持续抗原刺激下增强T细胞的抗原特异性杀伤能力。

总结

在CAR结构中加入共刺激信号基序显著增强了其功能，从而改善了血液系统恶性肿瘤患者的临床疗效。这里推测，在TCR复合物的CD3ζ分子中引入共刺激基序，同样可通过使TCR与pMHC结合后同时传递第一信号和第二信号，来提升TCR-T细胞的抗肿瘤效力。

展示的原代人CD3+ T细胞数据表明，当含CD28信号基序的CD3ζ构建体与治疗性TCR（CMV-TCR）共表达时，可生成抗原特异性IL-2和TNFα分泌增强、体外扩增能力提高、并在持续抗原刺激下仍保持抗原特异性杀伤能力的T细胞。这些结果凸显了含CD28基序的CD3ζ构建体在驱动抗原特异性T细胞扩增中的作用——此类T细胞既能持续分泌效应细胞因子，又能有效杀伤靶细胞。

利用两种不同的Jurkat细胞系模型发现，带有额外CD28基序的CD3ζ能够组装出可表达于细胞表面的CD3–TCR复合物，并介导增强的抗原特异性IL-2分泌。含CD28的CD3ζ构建体在实现高水平CD3–TCR表达方面效率低于野生型CD3ζ，这一现象提示IL-2反应的增强源于CD28信号通路本身，而非TCR亲和力的提高。正如其他研究人员所观察到的，表达带CD137信号结构域CD3ζ的TCR-T细胞并未表现出细胞功能改善，而含CD28信号结构域的TCR T细胞则有此效应。改良CD3ζ构建体未出现任何抗原非依赖性的基础性信号激活——这种现象在CAR-T细胞中曾与CRS及T细胞快速耗竭相关。此外，还证实，表达CD3ζ–CD28构建体的TCR-T细胞的效应功能不依赖内源性CD3ζ的存在，表明无需预先敲除CD3ζ。

在原代人T细胞中进行的实验表明，含有CD28基序的CD3ζ构建体可类似地增强TCR表达，并提升抗原特异性IL-2与TNFα的分泌。体外观察到T细胞扩增显著增加，但抗原特异性细胞毒活性未受损害。表达含CD28基序CD3ζ构建体的TCR-T细胞所额外分泌的IL-2与TNFα，可能以自分泌方式作用于T细胞自身，从而促进其活化。

综上所述，这些数据表明，表达含CD3ζ的CD28信号基序的T细胞可能克服PD-1或LAG3介导的抑制性刺激等抑制信号。这一潜力在体外刺激21天后PD-1和LAG3水平降低、促活化细胞因子分泌增强以及T细胞扩增增加等现象中得到印证。人们推测，在T细胞抑制性微环境中，这类经改造的细胞相比传统T细胞疗法可存续更久，从而产生更持久的治疗效果；不过，尚需借助更多聚焦于这些构建体对耗竭影响的模型加以验证。其次，在持续抗原刺激与扩增过程中，携带额外CD28-CD3ζ或CD3ζ-CD28结构的细胞展现出更持久的抗原特异性细胞毒活性，提示含此类基序的T细胞有望实现长期肿瘤清除，降低疾病复发或进展的风险。上述两项颇具前景的优势均在本研究的体外模型中得以凸显。

尽管这里成功凸显了利用含CD3ζ的CD28增强T细胞功能这一令人振奋的新思路，但仍需借助体内肿瘤模型进一步验证其是否能切实改善治疗效果。此类模型还可进一步探究含CD3ζ的CD28能否克服T细胞耗竭信号——已初步提示这种可能性。此外，还需将含CD3ζ的CD28与这里所用CMV特异性TCR以外的其他TCR联合使用，以进一步评估脱靶效应。由于现有数据表明，表达含CD3ζ的CD28的T细胞较表达野生型CD3ζ的T细胞更为敏感，因此含CD3ζ–CD28的T细胞有可能被低亲和力的交叉反应性多肽激活，而这类多肽通常无法激活仅表达CD3ζ的T细胞。这种交叉反应风险尚需通过更深入的体外及体内实验加以验证。

该体外研究证实，在CD3ζ中加入CD28信号基序可增强抗原特异性IL-2分泌及T细胞扩增，同时不损害其杀伤活性或功能亲和力。此类“新一代”TCR-T细胞的开发有望提升其在难治性实体瘤中的体内抗肿瘤疗效，从而提高TCR疗法的临床疗效。

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