这里有 16 种常用实验细胞的培养方案_MCE 中国

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常见细胞培养方案

本期推文聚焦 16 种细胞的培养及注意事项！

表 1. 疾病研究常用的实验细胞。

U87MG 细胞

人脑星形胶质母细胞瘤细胞，具有上皮形态，是源自中枢神经系统恶性肿瘤的细胞系。增殖速度快、侵袭性强，还存在明显的遗传与表型异质性[1]。

培养条件：DMEM 培养基，10% 胎牛血清 FBS，1% 青霉素链霉素双抗，2 mM L-谷氨酰胺[2]。

图 1. U-87 MG 细胞低密度和高密度生长形态[3]。

注意事项：

1. 细胞贴壁能力较弱：消化时间短，严格把控时间 (细胞回缩、间隙变大且部分脱落时，加 2-3 mL 完全培养基终止消化)；试剂需充分预热，避免室温放置过久。

2. 易聚集成团：胰酶充分消化并吹散，镜检确认单细胞状态；必要时用多聚赖氨酸包被培养器皿；避免密度过高、血清不适。

3. 血清要求高：选用高品质专用培养基及血清，保障生长速度与贴壁性。

4. 控制接种密度：传代比例 1:2-1:4，70%-80% 密度时传代；密度过低生长缓慢，过高易聚团。

MDA-MB-231 细胞

典型的三阴性乳腺癌 (TNBC) 细胞，具有高侵袭性和转移性[4]。

培养条件：Leibovitz’s L-15 培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗[5]。

图 2. MDA-MB-231 细胞低密度和高密度生长形态[6]。

注意事项：

1. 接种密度：细胞生长偏慢，传代比例推荐 1:2，避免密度过低。

2. 操作注意：对机械损伤敏感，消化吹打需轻柔、次数少，防止细胞形态异常或生长受阻。

HGC-27 细胞

人胃癌细胞，来自于未分化胃癌，能产生并分泌黏液素[7]。

培养条件：RPMI 1640 培养基，10% 胎牛血清，2 mM 谷氨酰胺，10 mM HEPES[8]。

图 3. HGC-27 细胞低密度和高密度生长形态[9]。

注意事项：

1. 定期换液与污染监测：每 2-3 天换液，防止废物堆积或 pH 波动；定期查细胞形态、增殖，排查污染。

2. 接种密度：传代比例 1:2 ~ 1:4，70% - 80% 汇合度时传代。

3. 控制胰酶消化时间：避免过长损伤细胞。

4. 冻存复苏温度要求：冻存缓慢降温，复苏快速升温，减少损伤。

5. 复苏后换液原则：24 小时后首次换液，避免频繁操作。

H22 细胞

小鼠肝癌细胞，分离自小鼠腹水，为悬浮细胞，呈淋巴母细胞样[10]。

培养条件：RPMI-1640培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗[11]。

注意事项：

1. 小鼠饲养时长：腹水接种后，小鼠饲养时间以 5 天为佳；饲养过久易导致小鼠死亡，且腹水中红细胞含量会显著升高。

2. 细胞冻存前培养时间：分离得到的腹水细胞建议先体外培养 8 小时左右再进行冻存，既能有效去除残留红细胞，又可使细胞状态调整至最佳。

3. 体外培养传代周期：H22 细胞体外培养增殖时，需在 5 代内进行一次腹水培养；若长期体外传代超过 5 代，细胞状态会急速变差，碎片明显增多。

4. 收集腹水红细胞过多时，可以用红细胞裂解液去除；用分离液分离细胞时，可多次分离筛选，保证细胞的纯度。

5. 腹水接种后，腹水长出时间会因细胞活力、接种细胞量的不同而存在差异；可通过观察小鼠状态判断接种是否成功，成功接种的小鼠活动力会出现明显减弱。

CHO-K1细胞

中国仓鼠卵巢细胞，实验中常用的一个细胞株，上皮样细胞，培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染[12]。

培养条件：Ham's F-12 培养基，10% 胎牛血清[13]。

图 4. CHO-K1 细胞低密度和高密度生长形态[14]。

注意事项：

1. 接种前可将完全培养基置于培养箱平衡 15 min 以上，使 pH 稳定在 7.0-7.6。

2. 消化时避免摇晃培养瓶，可 37℃ 孵育加速消化。

3. 血清蛋白可竞争性抑制胰酶活性。

4. 传代比例为 1:4-1:8。

5. 冻存密度控制在 1-10×10? cells/mL。

6. DMSO 需最后添加，加完后迅速转移至低温环境梯度冻存。

Caco-2 细胞

人结肠腺癌细胞，贴壁生长，为多边形或梭形，增殖速度较快[15]。

培养条件：DMEM 培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗，1% 非必需氨基酸[16]。

图 5. Caco2 细胞低密度和高密度生长形态[17]。

注意事项：

1. 控制接种密度 2-4×104 cells/cm2，密度过高/过低易导致分化异常或增殖延迟；80-90% 融合时传代，间隔 3-5 天，避免频繁操作。

2. 细胞贴壁速度较慢，尤其是复苏初期，通常需要 2-3 天才能完成贴壁并铺展，期间细胞易出现空泡结构。

3. 传代时，需确保胰酶消化后细胞充分分散为单细胞，否则会影响后续贴壁效果。

4. 该细胞呈成团生长特性，细胞密度越高，胞体表面的空泡及黑点数量也会随之增多。

5. 汇合度达 80% 时进行传代，此时细胞虽成片分布，但实际密度已处于较高水平。

6. 若细胞过度汇合、生长过满，会严重影响细胞状态，传代后易出现碎裂、死亡的情况。

7. 细胞培养时间越长，所需的胰酶消化时间也相应增加。

VSMC 细胞

血管平滑肌细胞，是构成血管壁中膜的核心细胞类型，在血管生理功能调节和病理重构中发挥关键作用[18]。

培养条件：DMEM 培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗[19]。

图 6. VSMC 细胞低密度和高密度生长形态[20]。

注意事项：

1. 避免反复冻融，未用完冻存液需丢弃。

2. 细胞汇合度 80%~90% 时传代，首次传代 1:2 接种。

3. 消化时严格控制 0.05% 胰酶-EDTA 作用时间 (2~3 分钟)，避免过度消化导致细胞成团或死亡；镜下观察细胞变圆、少量脱落时立即用含血清培养基终止。

4. 沿瓶壁缓慢吹打 20~30 次至单细胞悬液，避免垂直吹打和产生气泡，减少机械损伤。

5. 选取对数生长期 (汇合度 70% 左右)、健康无污染的低代次细胞 (≤10 代) 冻存，避免老化细胞。

HUVEC 细胞

人脐静脉内皮细胞源于脐带静脉组织，具有易消化解离、较快的增殖速度以及成熟的培养体系等特点[21]。

培养条件：DMEM 培养基，10% 胎牛血清，4 mM L-谷氨酰胺[22]。

图 7. HUVEC 细胞低密度和高密度生长形态[23]。

注意事项：

1. 避免反复冻融，未用完冻存液需丢弃。

2. HUVEC 贴壁依赖基质，未包被会降低贴壁率 (原代细胞尤甚)。

3. 细胞汇合度 80%~90% (铺路石样铺满，无重叠 / 管腔样结构)，避免过度汇合，会加速细胞老化。

4. 用宽口移液管沿瓶壁吹打，避免垂直吹打；密度过低可加 10ng/mL VEGF 促存活。

HCMEC/D3 细胞

永生化人脑微血管内皮细胞，贴壁生长，呈细长梭形。

培养条件：ECM 培养基，5% 胎牛血清[24]。

注意事项：

1. 细胞汇合度达 80% 时操作，按 1:2~1:3 比例传代。

2. 细胞悬液 “Z” 字打入含 7ml 培养基的 10cm 皿，轻柔十字晃匀不超过 10 下，静置后镜检再放入培养箱。

3. ECM细胞培养基含光敏成分，需避光 4℃ 保存，配制后 1 个月内用完。

PBMCs 细胞

人外周血单个核细胞，其中 70%-90% 是淋巴细胞，是适应性免疫和固有免疫的核心成分。单核细胞占 10%-30%，是固有免疫的重要组分[25]。

注意事项：

1. 样本预处理

抗凝全血与等体积 PBS (或生理盐水) 轻柔混匀，降低粘稠度。15/50 mL 离心管预先加入 Ficoll 分离液 (体积为全血的 1/2~1/3)，避免管壁残留液滴。

2. 梯度离心

倾斜离心管，沿管壁缓慢将稀释血加至 Ficoll 液上层，避免扰动界面。400×g、室温离心 20~30 分钟，离心机启停速度调至最低。离心后自上而下分为：血浆/ PBS 层、白膜层 (PBMCs)、Ficoll 层、粒/红细胞沉淀层。

3. 收集与洗涤 PBMCs

无菌移液管小心吸取白膜层 (1~2 mL)，转移至新离心管，避免吸入上下层液体。加 10 mL 含 2% FBS 的 PBS，300×g 室温离心 5 分钟，弃上清，重复洗涤 1~2 次。若残留红细胞，加 2~3 mL ACK 裂解液室温孵育 3 分钟，再用 PBS 洗涤 1~2 次。

4. 细胞计数与保存

适量 RPMI 1640 培养基或 PBS 重悬细胞，过 70 μm 细胞筛。将 10 μL 细胞悬液用台盼蓝染色后在显微镜下计数，确定活细胞浓度。

BMDC 细胞

骨髓来源树突状细胞，从骨髓细胞诱导产生树突状细胞。

培养条件：RPMI-1640 培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗，1% L-谷氨酰胺，0.1% β-巯基乙醇[26]。

BMDC 如何诱导分化？

1. 向骨髓细胞培养基中加入重组小鼠 GM-CSF (终浓度 20ng/mL) 和 IL-4 (终浓度 10ng/mL)。

2. 37℃、5% CO?培养 2~3 天后，吸出部分上清，补充新鲜培养基及细胞因子。

3. 培养 5~8 天期间，按步骤 2 补加培养基和细胞因子；收集细胞至离心管，300×g 室温离心 5min，弃上清。

4. 用含 10% FBS、20ng/mL GM-CSF、10ng/mL IL-4 的 RPMI-1640 完全培养基重悬细胞，计数后分装至 T25 培养瓶，补加新鲜培养基，继续培养 24~48h。

5. 细胞聚集成团后，轻柔吹打脱落，收集悬液即为成熟 BMDC。

RAW 264.7 细胞

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，呈现出典型的巨噬细胞特征，多为圆形或不规则形，贴壁生长，适宜条件下出现伪足结构[27]。

培养条件：DMEM 培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗[28]。

图 8. RAW264.7 细胞低密度和高密度生长形态[29]。

注意事项：

1. 极易发生极化，因此避免胰酶消化，防止诱导细胞分化；不使用 PBS 冲洗，避免刺激极化。

2. 细胞密度达 80%-90%、培养基变黄时及时传代，避免密度过高或叠加成层引发自发分化。

3. 观察细胞形态：圆形/椭圆形变为四角形或伸出伪足时，需立即传代，少量分化属正常现象。

4. 严格使用指定培养基，血清不可随意更换；室温保持 18-25℃，避免低温诱导极化。

5. 传代代数控制在 15 代内，超过后代极化概率升高。

THP-1 细胞

源自人急性单核细胞白血病患者的外周血细胞系，未分化时呈圆形，悬浮生长。诱导分化为巨噬细胞后贴壁生长，呈梭形/多角形等扁平状，是研究单核-巨噬细胞谱系的理想模型[30]。

培养条件：RPMI-1640 培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗，2 mM L-谷氨酰胺[31]。

图 9. THP-1 细胞低密度和高密度生长形态[32]。

注意事项：

1. 冻存复苏：THP-1 细胞复苏难度高，冻存密度需保证 5×10?-10?个 /ml，避免密度过低导致复苏后状态差。

2. 细胞碎片：培养中出现碎片，可待细胞密度提升后通过低速离心去除。

3. 细胞聚团：少量聚团可待细胞密度扩大后自行改善；严重聚团可提高 FBS 用量或适度吹散。

4. 贴壁现象：传代后轻微贴壁可轻吹收集或丢弃贴壁细胞；贴壁较多需检查培养条件是否适宜。

Naive CD4+ T 细胞

小鼠脾脏细胞，是尚未接触过抗原的 T 辅助细胞。采用磁珠分选方法进行分离，基于抗原和抗体特异性结合，利用表面偶联特异性抗体，精准捕获目标细胞，再通过磁场实现快速分离，具有纯度高、操作简便、对细胞活性影响小的特点[33]。

培养条件：RPMI 培养基，10% 胎牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素链霉素双抗，β-巯基乙醇[34]。

『如何培养？』

1. 样本准备：单细胞悬液 (如 PBMCs、组织消化液) 离心洗涤，用缓冲液重悬并调整浓度。

2. 磁珠孵育：按比例加入磁珠，4℃或室温避光孵育 10-30 分钟，期间轻柔混匀。

3. 磁场吸附：将离心管放入磁力架，静置 2-5 分钟，待磁珠细胞复合物完全吸附。

4. 洗涤纯化：移除上清，加入缓冲液洗涤 2-3 次，每次吸附后弃上清。

5. 洗脱收集：脱离磁场，用适量缓冲液或培养基重悬细胞，获得纯化的目标细胞。

BMSCs 细胞

大鼠骨髓间充质干细胞，具有多向分化潜能。

培养条件：DMEM 低糖培养基，10% 胎牛血清[35]。

『如何培养？』

1. 完全培养基重悬细胞，T25 培养瓶接种 (密度 1×10?细胞 / 瓶)；

2. 37℃、5% CO?培养，静置 24 小时后首次换液 (去除未贴壁细胞)；观察长梭形、集落状贴壁细胞。

3. 传代：80% 融合时胰酶消化 2-3 分钟 (镜下见细胞回缩)，加含血清培养基终止，离心后重悬，按 1:2 或 1:3 接种；

GC-1 spg  细胞

小鼠精原细胞，上皮样细胞，贴壁生长。

培养条件：DMEM 培养基，10% 胎牛血清，1% 青霉素链霉素双抗[36]。

『细胞传代小妙招』

1. 细胞密度 >80% 时传代，弃旧培养液。

2. PBS 轻柔冲洗细胞 2-3 次 (可摇晃培养瓶增强效果)。

3. 加预热胰蛋白酶覆盖细胞层，轻晃培养瓶助消化。

4. 镜下观察 90% 细胞脱落 (约 1min)，加 2-3ml 完全培养基终止消化。

5. 细胞悬液转入 15ml 离心管，1200rpm 离心 3min。

6. 弃废液，2ml 完全培养基重悬细胞后分装至新瓶。十字晃动培养瓶使细胞均匀分布，置于 37℃、5%-10% CO? 培养箱。

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小结

不同细胞的培养需求各有差异，本期我们聚焦 16 种常用细胞，整理分享了实操性极强的培养经验。希望这些干货内容能切实帮到大家，让细胞培养更顺利、更高效！

参考文献

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