类器官琼脂糖石蜡包埋HE攻略

类器官的包埋处理流程与组织包埋处理流程基本一致，但由于类器官相当于分散的许多小个体，而组织是一个大的聚合体，类器官在脱水中易散开、丢失，为了方便包埋时的夹取、确定切片位置，需要进行琼脂糖辅助包埋处理。类器官因来源不同，形态和培养方式也不一样，收集的困难程度也各有差异，根据不同的类器官可以采用不同的收集方法，使用不同的琼脂糖包埋法进行脱水前处理。

常规琼脂糖包埋法：适用悬浮培养的类器官、易除胶且除胶后不破的空泡状类器官、偏实心类器官。

原位琼脂糖包埋法：适用除胶后易碎的类器官、或数量较少的类器官。

一、类器官包埋

1、常规琼脂糖包埋法

（1）类器官收集

a、类器官直径在 200um 左右收集类器官。

b、移液枪吸去培养基，每孔添加 1-2ml 4℃ 类器官传代培养缓冲液（abs9730）放置2min，此过程保持动作轻柔。

c、移液枪轻柔吹打基质胶，收集在 15ml 离心管中，4℃静置 30min。（每4 孔为一组）

d、离心 5min 弃去上清，用 200ul 移液器吸取多余基质胶，此步骤尽量去除多余基质胶，类器官收集后，添加组织固定液重悬，转移到 1.5mlEP 管中（在类器官转移过程中用血清润洗枪头防止类器官挂壁）。

（2）琼脂糖包埋

a、取 0.2 到 0.4 克的琼脂糖粉末，加入 10 毫升的去离子水缓冲液中，放入水浴锅内 65-70℃加热至完全融化。使用移液枪吸取融化后的琼脂糖溶液0.6 毫升，转移至新 1.5 毫升离心管内。

b、取 0.5 毫升离心管，将其插入 1.5 毫升离心管中，等待琼脂糖凝固后，取出 0.5 毫升离心管，形成凹槽。

c、类器官加入 30ul 伊红进行预染，颠倒混匀后进行离心，1000 转 5分钟，弃掉多数上清，底部保留20-30ul上清，将沉淀吹匀，然后将悬液加入到步骤 2 形成的凹槽中，加入 PBS 缓冲液稍微覆盖过琼脂糖。

d、离心 1000 转，离心 5min，去除上清液。该步骤重复两次，洗去残留的多聚甲醛和伊红。

e、离心完成后，向凹槽中加入适量的琼脂糖，使用移液枪轻轻吹吸，使琼脂糖完整包裹住类器官。

f、待琼脂糖室温凝固后，取出琼脂块。

g、琼脂块放入离心管内，多聚甲醛浸泡处理 12h。

2、原位琼脂糖包埋法

（1）类器官收集

a、类器官直径在 200um 左右收集类器官。

b、移液枪吸去培养基（不要碰到胶滴），每孔添加 1.5ml 多聚甲醛直接固定（固定12h）。

3、琼脂糖包埋

a、在 24 孔板中滴入伊红 20ul，并用移液枪轻轻吹打混匀，静止 5min，对胶滴进行初步染色处理。

b、使用移液枪轻轻触动胶滴，让胶滴与孔板底部分离，去除多聚甲醛并用PBS 清洗去除残余多聚甲醛。

c、取 0.2 到 0.4 克的琼脂糖粉末，加入 10 毫升的去离子水缓冲液中，放入水浴锅内 65-70℃加热至完全融化。使用移液枪吸取融化后的琼脂糖溶液加入 24 孔板中，用移液枪调整胶滴位置，使胶滴悬浮在琼脂糖溶液中。

d、冷却后修除多余琼脂块，只留下含有胶滴的区域。

大家了解了上述两种琼脂糖包埋方法以后，接下来我们来了解琼脂糖的脱水及石蜡包埋方法。

二、脱水

1、梯度乙醇进行脱水处理，依次使用 70%、80%、90%和 95%的乙醇各浸泡 40 分钟。

2、使用无水乙醇中浸泡 40 分钟，重复两次，彻底脱水。

3、使用无水乙醇与二甲苯按 1:1 的比例混合的溶液浸泡样本 30 分钟。

4、使用二甲苯中浸泡两次，每次 30 分钟。

5、完成上述步骤后，将样本放入 60℃的蜡缸中进行浸蜡处理，重复两次，每次 30 分钟，之后进行包埋。

三、石蜡包埋

1、将包埋模具中加入适量蜡液，琼脂块放入模具正中央后移动至包埋机冷冻台，待底部泛白凝固后，将包埋盒放在包埋模具上，加入蜡液填满包埋盒。

2、将包埋模具放在冻台上等待蜡液完全凝固后方可脱模。

四、切片

1、将包埋好的蜡块体放入-10℃的冷冻环境中冷冻 5 分钟，将包埋块夹在样本夹。

2、调整刀座与包埋块的距离，先进行粗修，直至组织（琼脂块）露出大约80%。

3、继续进行细修，直至组织露出大约 95%，或者在显微镜下观察到琼脂块中有 细胞为止。

4、将切好的切片放置在 45℃的温水中展平，直到没有褶皱，使用玻片捞出。

5、根据组织和琼脂块的具体情况，适当调整切片的厚度。

6、将切片写上编号后，放入烤箱中在 65℃的温度下烘烤 2 小时。

五、HE 染色步骤

1、脱蜡至水

（1）脱蜡过程：将石蜡切片依次浸入 3 道二甲苯中，每个 5 分钟，以溶解石蜡。

（2）水化过程：使用梯度酒精（从 100%开始递减至 70%），依次浸泡 5 分钟，最后用蒸馏水浸洗 1 分钟，玻片没有水雾就可以进行后续染色。

2、苏木精染色

（1）染色过程：在切片上滴加苏木精染液，持续 5 分钟后，用流水冲洗，以去除多余的染液。

（2）分化过程：使用分化液对切片进行分化处理，持续 10 秒后，再次用流水冲洗，去除多余的分化液。

（3）返蓝过程：使用返蓝液对切片进行返蓝处理，持续 10 秒后，用流水冲洗，去除多余的返蓝液。

3、伊红染色

染色过程：在切片上滴加伊红染液，持续 2 分钟后，用流水冲洗，去除多余的伊红。

4、脱水与透明

（1）脱水过程：使用梯度酒精（从 70%开始递增至 100%），每种浓度浸泡 2 分钟，确保彻底脱水。

（2）透明过程：将切片放入 2 道二甲苯中，每个浸泡 5 分钟，使组织变得透明。

5、封片

封片过程：在组织上滴加适量的中性树胶，盖上盖玻片，避免产生气泡，自然晾干。