GST抗体助力人类 KICSTOR 复合体研究

2025年11月6日，南方科技大学医学院生化系苏明媛课题组与合作者于《Nature Structural & Molecular Biology》发表题为"Architecture of the human KICSTOR and GATOR1--KICSTOR complexes"的文章，该文主要利用冷冻电镜技术并结合生物化学与细胞生物学手段，首次解析了人源KICSTOR复合物及其与GATOR1组成的超复合物的高分辨率三维结构，系统阐明了KICSTOR作为支架蛋白将GATOR1锚定至溶酶体膜、从而调控mTORC1信号通路的分子机制。

研究背景

KICSTOR是由KPTN、ITFG2、C12orf66和支架蛋白SZT2组成的异源四聚体复合物，其功能是将mTORC1的抑制因子GATOR1锚定在溶酶体表面，在营养感知与mTORC1信号调控中起关键作用。KICSTOR亚基的突变与严重的神经发育性疾病和癫痫相关，但其结构组装及与GATOR1相互作用的机制尚不明确。

图 1 人类 KICSTOR 复合体的冷冻电镜结构 a. 人源 KICSTOR 亚基的结构示意图。虚线标注未解析区域。b.纯化的 KICSTOR 蛋白考。C.人源 KICSTOR 复合物的 Superose 6 尺寸排阻色谱图。星号标注对应 KICSTOR 的色谱峰。d.KPTN、ITFG2、C12orf66和支架蛋白SZT2 四部分。E.人源 KICSTOR的Cryo-EM density map (左) and model(右)

文章发现：

1. KICSTOR的结构解析
- 作者共表达了KICSTOR的四个蛋白组分，纯化后，通过冷冻电镜解析了全长KICSTOR及其C末端核心复合物（CCC）的多种构象状态，分辨率在2.90--3.19 Å之间。
- SZT2呈现为新月形的长柄结构，由12个串联的SZ单元组成，其C末端通过SZ7单元与C12orf66结合，并通过SZ4和SZ5单元分别与KPTN--ITFG2异二聚体相互作用。
- KPTN与ITFG2形成WD40 β-propeller结构，并通过C末端螺旋相互稳定。
- C12orf66具有类似Roadblock结构域和Brox家族的结构特征，其N端结构域与SZT2的C末端螺旋结合。

图 2 Structure of the KICSTOR subunits.

2. KICSTOR与GATOR1的相互作用
- 通过解析KICSTOR--GATOR1超复合物结构（分辨率2.97 Å），发现GATOR1通过其亚基NPRL3与SZT2的N端结构域结合。
- 关键界面残基包括SZT2的E115、D119、E194、D195与NPRL3的R147、R148、H155等，这些残基的突变显著削弱二者结合。
- 在NPRL3基因敲除细胞中重新引入野生型NPRL3后，mTORC1对氨基酸的敏感性得以恢复。相比之下，SZT2结合缺陷的突变体（包括 NPRL3Δ216 −231以及NPRL3的单点或组合突变体R147G、R148G和H155A）未能恢复对氨基酸剥夺的敏感性。说明KICSTOR复合体对于GATOR1完全抑制mTORC1活性是必需的
- 交联质谱分析进一步验证了SZT2与NPRL3之间的特异性相互作用，未检测到SZT2与GATOR1其他亚基的交联。

图 3 Cryo-EM structure of the human GATOR1--KICSTOR complex

图 4 人类GATOR1--kicstor复合体的相互作用及其对mTORC1信号通路的影响

3. KICSTOR不改变GATOR1的GAP活性
体外GTP酶实验表明，KICSTOR的存在不影响GATOR1对RagA/B的GAP活性，说明其主要功能是作为支架将GATOR1定位至溶酶体，而非调节其催化效率。

图 5 KICSTOR does not impact the GAP activity of GATOR1 toward Rag GTPases

4. KICSTOR通过静电作用与溶酶体膜结合
- 脂质体结合实验表明，KICSTOR优先与带负电荷的脂质结合，如磷脂酰丝氨酸和多种磷酸肌醇。
- SZT2和C12orf66是膜结合的关键亚基，两者表面具有正电荷斑块，可能与带负电的脂质头基相互作用。
- KPTN--ITFG2异二聚体本身无膜结合能力，其表面电势以负电为主。

图 6 KICSTOR复合体的膜相互作用

5. KICSTOR的溶酶体定位依赖SZT2与C12orf66
- 细胞成像实验显示，SZT2与C12orf66共同表达时才能将KICSTOR定位至溶酶体。
- 破坏SZT2--C12orf66相互作用（如C12orf66 L216D/F269D突变）导致KICSTOR在胞质中错误定位。

6. 功能验证：SZT2--GATOR1相互作用对mTORC1调控至关重要
- 在NPRL3或SZT2敲除细胞中，破坏SZT2--NPRL3相互作用的突变体无法恢复mTORC1对氨基酸饥饿的敏感性。
- TFE3--GFP核质穿梭实验进一步证实，SZT2突变导致mTORC1持续活化，TFE3滞留在胞质中。

图 7 Characterization of KICSTOR lysosomal targeting

结论

本研究首次从结构上揭示了KICSTOR作为长柄新月形支架，通过其C末端组装KPTN--ITFG2和C12orf6，并通过N端与GATOR1的NPRL3结合，从而将GATOR1锚定至溶酶体膜。KICSTOR通过SZT2和C12orf66与带负电荷的溶酶体膜脂质相互作用，实现其膜定位。该工作阐明了KICSTOR在营养感知通路中的支架功能，为理解其突变导致神经发育疾病的机制提供了结构基础。