靶向KRAS G12V的TCR用于胰腺癌的单臂1/2临床试验

靶向KRAS G12D的过继性T细胞输注可诱导晚期上皮性肿瘤退缩。靶向KRAS G12V的TCR-T细胞的安全性、有效性，以及重复输注的潜在获益尚不明确。在一项单臂1/2期临床试验（NCT04146298）中，海军军医大学附属长海医院，采用经基因工程改造、表达HLA-A*11:01限制性KRAS G12V 8–16特异性TCR的自体T细胞，对5例复发性胰腺癌患者实施过继性细胞输注治疗；其中3例患者接受了多次输注。主要终点为安全性及客观缓解率。≥3级最常见不良事件为淋巴清除所致的血液学毒性。1例伴肝转移的患者获得持续5.5个月的CR，另有2例患者出现短期疾病稳定。首次输注后一个月，4例患者的外周血中可检测到TCR-T细胞。再次输注TCR-T细胞未观察到临床缓解。在2名患者中，再次输注后出现TCR-T细胞的超急性排斥反应，推测其机制可能与既往TCR-T细胞输注所诱导的、持续存在的、针对该工程化KRAS G12V反应性TCR的抗体有关。初步证实了HLA-A*11:01限制性靶向KRAS G12V的TCR-T细胞在复发性胰腺癌患者中应用的安全性与治疗潜力，并为重复输注策略提供了重要参考。

此前，海军军医大学附属长海医院团队在一名胰腺癌患者体内鉴定出一种由HLA-A*11:01限制的TCR，该受体靶向KRAS G12V8-16（VVGAVGVGK）新抗原表位。这一表位与另一项研究报道的TCR所识别的9个氨基酸长度的新抗原表位完全相同。此外，经基因工程改造、表达该TCR的T细胞可特异性识别并杀伤胰腺癌类器官，并显著延缓类器官来源的异种移植瘤在免疫缺陷小鼠体内的生长。这表明，该9肽KRAS G12V新抗原表位可在肿瘤细胞内被天然加工并呈递至细胞表面，且呈递水平足以被TCR识别；这一结论亦与他人通过质谱技术在肿瘤细胞中检测到该新抗原表位的结果一致。鉴于几乎所有晚期PDAC患者即便接受gemcitabine联合白蛋白结合型紫杉醇、FOLFIRINOX方案或纳米脂质体irinotecan联合氟尿嘧啶等当前最佳标准治疗，最终仍会死于疾病进展，这里启动了一项开放标签、单臂的1/2期临床试验（NCT04146298），旨在评估向HLA-A*11:01阳性、且肿瘤表达突变型KRAS G12V的晚期胰腺癌患者输注经基因工程改造、表达HLA-A*11:01限制性突变KRAS G12V 8–16特异性TCR的自体T细胞的安全性与有效性。还探索了在疾病进展后对患者重复输注该T细胞的可行性。这里报告了此项正在进行的临床试验所开展的非预设中期分析结果，内容包括治疗相关不良事件、临床疗效、T细胞在体内的持续存留情况、血浆细胞因子水平以及血浆中anti-TCR抗体水平。

HLA-A*11:01 限制性靶向KRAS G12V的TCR-T细胞产品的制备与表征

为制备TCR-T细胞产品，将冻存的PBMC复苏后，用经人源化CD3和CD28激动剂（符合GMP标准的T细胞活化试剂T Cell TransAct™）修饰的聚合物纳米基质及IL-2进行刺激，并以编码该TCR的慢病毒颗粒进行转导。鉴于本TCR依赖CD8共受体，若所得TCR-T细胞中CD8阳性T细胞比例低于30%，则采用CD4磁珠去除CD4阳性T细胞。随后，在初次刺激约9–14天后，对转导后的T细胞实施快速扩增方案：以辐照处理的饲养细胞、IL-2及anti-CD3抗体进一步扩增细胞。继而在第二次刺激约10–17天后收获细胞，并回输给自体患者。所有用于患者的T细胞产品均通过质量控制检测及放行检测，符合分析证书（COA）所列标准，包括无菌性、内毒素水平、TCR表达水平、复制型慢病毒（RCL）、细胞活力及活细胞数量。

所有5名患者首次输注时，所用的TCR（TCR-001）包含小鼠来源的TCR-α和TCR-β恒定区，此举有助于外源导入TCR的正确配对，便于对经基因工程改造的T细胞进行检测，并已在临床研究中应用。这种自体产品由转导了人鼠嵌合型TCR-001的T细胞构成，命名为LV-TCR-001-m Td（其TCR序列见图0）。在3名接受重复输注的患者（Pt.003、Pt.006和Pt.007）中，为避免因首次输注产品含小鼠TCR序列而可能诱导产生抗体、继而导致免疫排斥的风险，改用另一种完全人源化的TCR（LV-4148 TCR-h Td）【10.1038/s41467-019-08304-z】，该TCR同样识别HLA-A*11:01限制性KRAS新表位。

此外，对TCR-T细胞产品的表型及体外功能进行了表征。如图1A–1C所示，不同患者及不同TCR之间转导效率存在较大差异（CD8 T细胞为38.0%–78.3%，CD4 T细胞为52.8%–87.5%），其中PD1+ T细胞极少，Fas+ T细胞占比超过97%，且T细胞亚群比例各异，包括干细胞样记忆T细胞（Tscm；CD62L+ CD45RO−）、中心记忆T细胞（Tcm；CD62L+ CD45RO+）、效应记忆T细胞（Tem；CD62L− CD45RO+）以及终末分化的CD45RA+效应记忆T细胞（Temra；CD62L− CD45RO−）。T细胞扩增工艺在相对较长的制备周期（中位数为26天，范围为20–30天）下，仍能产生较高比例的Tscm亚群（范围为20.3%–58.5%，中位数为44.7%）。无论是经TCR-001还是4148 TCR改造的T细胞产品，均对KRAS G12V8-16 9肽具有高度特异性；当以表达HLA-A*11:01的健康供者来源未成熟树突状细胞（imDC）为靶细胞，并用1μg/ml KRAS G12V8-16 9肽致敏后，在体外刺激条件下，转导后的CD8 T细胞显著上调4-1BB/OX-40和CD107a，并分泌IFN-γ、TNF等效应细胞因子（图1D–1E）。

图0 针对突变KRAS G12V的HLA-A*11:01限制性TCR并建立TCR转导的T细胞。

图1 对接受总计11次细胞输注的5名患者的输注产品进行表征。

患者及治疗特征

2021年9月至2023年7月期间，共有5例复发性胰腺癌患者纳入本研究的TCR-T治疗队列（表1、图2A）。这5例患者既往均接受过标准治疗，包括新辅助化疗（Pt.003、Pt.005和Pt.008）、根治性切除术及辅助化疗；在首次接受TCR-T治疗前，疾病已进展，表现为原发肿瘤复发或转移（表1）。对其原发肿瘤进行全外显子组测序显示，所有患者均为HLA-A*11:01阳性，且肿瘤携带KRAS G12V突变（表1）。患者在输注自体HLA-A*11:01限制性、靶向KRAS G12V8-16抗原的TCR-T细胞产品前，接受了非清髓性淋巴细胞清除预处理方案：环磷酰胺500mg/m²/天、氟达拉滨30mg/m²/天，连续3天；该方案显著降低了淋巴细胞与单核细胞数量，但对中性粒细胞、血小板及血红蛋白水平无明显影响。所输注的TCR-T细胞产品包括经人鼠嵌合型TCR-001慢病毒载体转导的T细胞（LV-TCR-001-m Td）或经全人源4148 TCR慢病毒载体转导的T细胞（LV-4148 TCR-h Td）（图2B、图3A）。其中3例患者（Pt.003、Pt.006和Pt.007）在疾病进展后接受了TCR-T细胞再治疗（图2B）。部分细胞输注过程中，研究者根据临床判断给予抗人PD-1药物替雷利珠单抗（图3A）。所有患者均未接受IL-2治疗。

表1 PDAC患者接受KRAS G12V A11 TCR-T细胞治疗的临床特征及疗效反应

图2 CONSORT流程图及临床研究流程图

图3 自体T细胞经基因工程改造后表达HLA-A*11:01限制性突变KRAS G12V特异性TCR的临床治疗反应。

治疗相关不良事件

主要目标之一是评估TCR-T细胞输注后治疗相关不良事件的发生频率和严重程度。5例患者共接受了11次细胞输注；所有级别的不良事件（AE）包括：5例患者（100%）均出现血液学毒性，5例患者（100%）及11次输注中的8次（73%）出现CRS，5例患者（100%）及11次输注中的8次（73%）出现寒战/发热，5例患者中1例（20%）及11次输注中1次（9%）出现低血压，5例患者中1例（20%）及11次输注中1次（9%）出现乏力，5例患者中1例（20%）及11次输注中1次（9%）出现红斑。≥3级不良事件中，发生率最高的是与淋巴细胞清除相关的血液学毒性，5例患者（100%）及11次输注中的10次（91%）均发生，具体包括：5例患者中3例（60%）及11次输注中4次（36%）出现白细胞减少，5例患者中1例（20%）及11次输注中1次（9%）出现中性粒细胞减少，5例患者（100%）及11次输注中的10次（91%）出现淋巴细胞减少，5例患者中1例（20%）及11次输注中1次（9%）出现血小板减少，5例患者中1例（20%）及11次输注中2次（18%）出现贫血；上述毒性均发生于细胞输注后28天内，且通常于28天内恢复，中位恢复时间为7天（表2）。Pt.003在第三次细胞输注前即存在持续性3级贫血。未观察到≥3级的CRS；所有报告病例中，1级和2级CRS多发生于细胞输注后1天内，且未经托珠单抗治疗，3天内可自行缓解。值得注意的是，Pt.003第二次TCR-T治疗及Pt.007第三次TCR-T治疗后约1–3h，体温升至近40℃，可能与机体对TCR-T细胞产品的超急性排斥反应有关；经吲哚美辛及物理降温后，体温恢复正常。Pt.003在第二次细胞输注约12h后出现低血压，经去甲肾上腺素治疗，2天内恢复。Pt.008于细胞输注后1天出现躯干及四肢红斑，约1周后恢复。未观察到神经毒性，亦无治疗相关死亡事件。

表2 血液学毒性汇总

临床反应与TCR-T细胞的超急性排斥反应

采用自体HLA-A*11:01限制性、靶向KRAS G12V8-16的TCR-T细胞，治疗了5例复发性PDAC患者。这5例患者在首次细胞输注时均接受了人鼠嵌合TCR-001修饰T细胞产品；其中3例患者还额外接受了人鼠嵌合TCR-001修饰T细胞产品或全人源4148 TCR修饰T细胞产品。1例患者（Pt.003）达到CR，另有2例患者（Pt.006和Pt.008）的最佳疗效为无肿瘤退缩的短期疾病稳定，依据《实体瘤疗效评价标准》（RECIST）1.1版（表1及图3B–3C）。中位无进展生存期和总生存期分别为14.3周和12.6个月（表1）。每位患者的临床病程详见图3A。

Pt.003（63岁男性）在首次细胞输注后6周，其4处肝转移病灶达到CR，该缓解持续了23.4周（表1及图3D）。Pt.003在首次细胞输注后29.4周出现疾病进展，病灶位于原发肿瘤部位，而非肝脏。一个月后，为其再次输注TCR-001基因改造T细胞，以评估再治疗是否有效。出乎意料的是，重复输注后1–3小时内，Pt.003即出现高热与寒战，临床表现符合对基因改造T细胞的排斥反应。因此，当Pt.003、006和007在既往接受人鼠嵌合型TCR-001基因改造T细胞产品输注后出现疾病进展时，改用全人源4148 TCR基因改造T细胞产品，以避免既往输注人鼠嵌合型TCR-001基因改造T细胞产品所诱导的抗小鼠TCR恒定区抗体引发的潜在超急性排斥反应。值得注意的是，Pt.005和Pt.008因肿瘤进展相关血小板减少症或凝血功能障碍，未接受全人源4148 TCR基因改造T细胞产品的再治疗。然而，Pt.003接受4148 TCR基因改造T细胞产品的第三及第四次输注后，仅获得持续7.9周的疾病稳定（表1及图3B）；Pt.006和007对4148 TCR基因改造T细胞产品的第二次输注则未见疗效（表1及图3B）。令人惊讶的是，Pt.007在第三次细胞输注后1–3小时内即出现针对全人源4148 TCR基因改造T细胞产品的超急性排斥反应征象，表现为高热与寒战。值得注意的是，Pt.003在首次及第四次TCR-T治疗后，血清CA19-9水平显著且持续下降；而其在其余两次治疗后及其他患者在TCR-T治疗期间，CA19-9水平仅短暂下降或呈持续上升趋势（图3E），该变化总体上与RECIST 1.1标准评估结果一致。

重复输注后，转导TCR-T细胞在体内的持续性减弱

采用流式细胞术，在接受治疗的5例患者（共接受11次细胞输注）的治疗后PBMC中，评估了TCR-T细胞的持续存留时间及扩增峰值（图4）。对于TCR-001基因改造T细胞输注：在Pt.006（首次输注）和Pt.008中，所有可获取PBMC样本的时间点均能检测到TCR-T细胞（图4A）；而在Pt.003（首次输注）、Pt.005及Pt.007（首次输注）中，TCR-T细胞分别持续存留28天、7天和33天（图4A），其存留时长与治疗反应之间未呈现明确相关性。值得注意的是，在Pt.003（第二次输注）中，自体来源的TCR-001转导T细胞于治疗后1天内在体内迅速耗竭（图4A），提示可能存在针对小鼠TCR恒定区的抗体，并可能介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。对于全人源4148 TCR基因改造T细胞输注：在Pt.006（第二次输注）中，所有可获取PBMC样本的时间点均能检测到TCR-T细胞，且持续存留超过190天（图4A）；而在Pt.003（第三次输注）、Pt.003（第四次输注）及Pt.007（第二次输注）中，TCR-T细胞则仅分别存留7天、1天和7天（图4A）。更重要的是，在Pt.007（第三次细胞输注，即第二次接受4148 TCR转导T细胞输注）中，全人源4148 TCR转导T细胞于治疗后3天内在外周血中迅速耗竭，仅在治疗后1天和3天的PBMC中以低水平检出（图4A）。TCR-T细胞在治疗后PBMC中的存留特征进一步通过KRAS G12V8-16-HLA-A*11:01 Tetramer染色得到验证。

图4 五名患者共接受11次TCR-T细胞输注后的体内存续情况。

在所有细胞输注中（排除两例超急性排斥反应病例），TCR基因工程化CD8 T细胞在PBMC中的中位最大百分比出现在第1天，为44.6%（范围：8.13%–76.75%，图4A）；TCR-T细胞的中位达峰浓度（Cmax）为每μL血液39.1个细胞（范围：0.0085–215.4，图4B）。中位达峰时间（Tmax）和中位末次可检出时间（Tlast）分别为7天（范围：1–53）和28天（范围：1–190）（图4B）。值得注意的是，在Pt.003（第4次输注）中，外周血内源性TCRVβ5.1+ T细胞的绝对数量自治疗后第7天起显著升高，这很可能反映的是由COVID-19感染诱发的淋巴细胞增多症（图4B），而非4148 TCR转导T细胞所致，因在治疗后第7天的PBMC样本中未检测到针对KRAS G12V的反应性。T细胞持续时间较短的患者（Pt.003的第3次与第4次细胞输注）其T细胞扩增峰值明显更低（图4）。CD4 TCR-T细胞的持续性与扩增模式与CD8 TCR-T细胞相似（图4）。此外，治疗后PBMC中的TCR-T细胞似乎仍保留效应功能：在体外经KRAS G12V8-16 9肽刺激后，它们特异性上调4-1BB/OX-40及CD107a，并分泌IFN-γ、TNF等效应细胞因子；尽管其反应强度不及各自输注制剂（图5）。

最后，对治疗后约一个月的PBMC（用于细胞输注，且T细胞具有相对较长的持续性）中的持续性TCR-T细胞表型进行了表征。结果发现，在持续存在的TCR转导CD8 T细胞中，PD1阳性T细胞极少；除Pt.003受试者在首次细胞输注后，其经改造的T细胞主要呈现效应记忆表型外，其余大多数细胞均表现为干细胞样记忆T细胞（Tscm）表型（CD62L阳性、CD45RO阴性、Fas阳性）。

图5 治疗后不同时间点PBMC中持续存在的TCR-001基因工程T细胞的体外效应功能评估。

TCR-T 细胞输注后CRP及细胞因子的变化

对全部5例患者，均在临床实验室检测了血清C反应蛋白（CRP）和血浆细胞因子水平，并在细胞输注过程中于多个时间点采集血浆用于研究。Pt.003（第1次及第2次输注）、Pt.005以及Pt.007（第3次输注）在细胞输注后出现血清CRP水平一过性升高，该现象与Pt.003（第2次输注）及Pt.007（第3次输注）发生的超急性排斥反应，以及Pt.005出现的短期存留（潜在排斥）相关。Pt.003（第2次输注）、Pt.005及Pt.007（第3次输注）的血浆IL-6水平分别于治疗后1天、3天及1天内迅速达峰，且峰值水平较高。然而，在全部5例患者治疗期间，血浆IFN-γ、TNF及其他细胞因子浓度变化甚微，提示TCR-T细胞在体内诱导的效应细胞因子应答相对较弱。

TCR-T 细胞输注后血浆中anti-TCR抗体的诱导

由于TCR-001是通过将人源TCR可变区与鼠源TCR恒定区融合构建而成，而患者Pt.003在第二次细胞输注后1–3h内即对自体TCR-001基因改造T细胞产品发生超急性排斥反应，采用间接检测法探究治疗后是否诱导产生了抗鼠源TCR恒定区的人源抗体。如图6A所示，将健康供者来源及Pt.003自体来源的TCR-001转导T细胞分别与Pt.003首次输注后第203天（D203）血浆共孵育，可显著抑制荧光标记的抗鼠源TCRβ恒定区抗体的染色信号，表明该血浆中存在抗鼠源TCRβ恒定区的人源抗体。在Pt.003与Pt.007中，抗鼠源TCRβ恒定区的人源抗体分别于首次输注后第84天和第64天开始出现（图6B、6C），此时PBMC中已无法检出相应的TCR-001转导T细胞（图4）。此类抗体的产生很可能导致Pt.003在第二次细胞输注时对TCR-001基因改造T细胞产品发生超急性排斥反应。如图6D所示，将健康供者来源及Pt.003自体来源的TCR-001转导T细胞与Pt.003首次输注后D203血浆共孵育，亦可显著抑制荧光标记的抗人TCR Vβ21.3抗体的染色信号——该抗体靶向TCR-001的TCR可变β链，提示血浆中存在抗人TCR-001可变区的人源抗体。在Pt.003与Pt.007中，血浆中抗人TCR Vβ21.3抗体的产生与抗鼠源TCRβ恒定区人源抗体的产生呈同步趋势（图6E、6F）。值得注意的是，Pt.003和Pt.007血浆中的抗人TCR Vβ21.3抗体并未抑制荧光标记的抗人TCR Vβ21.3抗体对小鼠TCRβ阴性、但内源性表达人TCR Vβ21.3的人T细胞的染色，表明血浆中的抗人TCR抗体可特异性识别经工程化改造的人TCR。在Pt.005、Pt.006和Pt.008的血浆中，均未检出抗小鼠TCRβ恒定区的人源抗体及抗人TCR-001可变区的人源抗体，提示针对异源TCR的抗体生成并非普遍现象。此外，在Pt.007接受全人源4148 TCR工程化T细胞产品第二次输注后第329天（即第三次输注前7天）的血浆中，检测到人源抗人TCR Vβ5.1抗体（对应4148 TCR的人源TCR可变β链）的诱导产生（图6G、6H），该抗体很可能导致了Pt.007在第三次输注时对4148 TCR工程化T细胞发生的超急性排斥反应。而在Pt.003和Pt.006接受4148 TCR工程化T细胞输注后，其血浆中均未检出人源抗人TCR Vβ5.1抗体（图6I、6J）。理论上，Pt.005体内TCR-001工程化T细胞的短期存续，以及Pt.003体内4148 TCR工程化T细胞的短期存续，可能源于内源性T细胞对TCR-T细胞的免疫应答；然而，在Pt.005治疗后的PBMC样本中，以及Pt.003第四次细胞输注后治疗期的PBMC样本中，均未检测到针对TCR-T细胞的T细胞应答。进一步通过先前描述的检测方法，检测血浆孵育后的TCR-T细胞表面的人IgG，证实了Pt.003和007血浆中存在抗小鼠TCRβ恒定区的人源抗体。结果发现，携带小鼠TCR恒定区的TCR-001基因改造T细胞经Pt.003和007血浆孵育后，可被抗人IgG抗体阳性染色，且该染色强度与荧光标记的抗小鼠TCRβ抗体染色减弱呈正相关。值得注意的是，同一份来自Pt.003和Pt.007的血浆（在输注LV-4148 TCR-T细胞之前）并未抑制4148 TCR基因改造T细胞表面荧光标记抗小鼠TCRβ抗体的染色——该细胞所表达的小鼠TCR恒定区与TCR-001 TCR-T细胞完全相同；同时，这些细胞表面亦未检出人IgG抗体，提示上述血浆中的人源抗小鼠TCRβ恒定区抗体还可识别位于小鼠TCR恒定区以外的表位（例如，该抗体可能识别包含小鼠恒定区与人可变区共同构成的表位）。此外，在Pt.007接受LV-4148-TCR-T细胞输注（第二次输注）后的血浆中孵育后，同样在携带与TCR-001相同小鼠恒定区的4148 TCR基因改造T细胞表面检测到了人IgG抗体。该现象伴随mTCRβ⁺的4148 TCR基因改造T细胞表面荧光标记抗人TCR Vβ5.1抗体染色显著降低，但在mTCRβ⁻的非4148 TCR基因改造T细胞中则无此现象，表明血浆中的抗人TCR Vβ5.1抗体靶向的是该工程化Vβ5.1 TCR特有的序列（例如其独特型），而不仅限于保守的Vβ5.1序列。上述结果表明，部分患者在接受TCR-T细胞输注后，既可产生抗小鼠TCR恒定区的人源抗体，也可产生抗人TCR可变区的人源抗体。

图6 患者输注TCR-001或4148 TCR基因工程T细胞后，血浆中抗TCR抗体的评估。

由于anti-TCR抗体可诱导T细胞活化，进一步检测了含有抗小鼠TCRβ恒定区人源抗体及抗人源TCR Vβ21.3人源抗体的血浆是否能够激活经工程化改造的T细胞。结果发现，Pt.003和Pt.007的血浆可诱导TCR-001工程化T细胞活化。此外，Pt.007在输注LV-4148 TCR-T细胞（第二次输注）后所采集的血浆中含有抗人源TCR Vβ5.1人源抗体，该血浆亦可诱导全人源4148 TCR工程化T细胞活化。值得注意的是，Pt.003和Pt.007血浆中含有的抗小鼠TCRβ恒定区人源抗体及抗人源TCR Vβ21.3人源抗体，并不能诱导非TCR-001工程化T细胞活化，表明血浆中anti-TCR抗体具有明确的抗原特异性。此外，Pt.003和Pt.007血浆中含有的抗小鼠TCRβ恒定区人源抗体可诱导TCR-001工程化T细胞活化，但不能诱导携带小鼠TCR恒定区的4148 TCR工程化T细胞活化；而Pt.007在输注LV-4148 TCR-T细胞（第二次输注）后血浆中含有的抗人源TCR Vβ5.1人源抗体，则可诱导携带小鼠TCR恒定区的4148 TCR工程化T细胞活化。Pt.003和Pt.007的血浆均不能激活非TCR-001工程化T细胞及非4148 TCR工程化T细胞，进一步证实了血浆中anti-TCR抗体的抗原特异性。

总结

本研究显示，对5例晚期胰腺癌患者采用靶向KRAS G12V突变的TCR-T细胞进行过继性细胞转移治疗具有可耐受性。所有患者均出现预期的、主要由淋巴细胞清除所致的短暂血液学毒性。其中1例患者达到CR，持续时间为5.5个月。另有3例患者在单次或多次重复输注细胞后未观察到临床疗效，这可能部分归因于TCR-T细胞发生的急性排斥反应。因此，结果表明，TCR-T细胞疗法有望拓展至靶向胰腺癌患者中除KRAS G12D以外的其他KRAS突变。更重要的是，首次发现，TCR-T细胞输注后可在人体内诱导产生抗人TCR可变区抗体，这类抗体很可能限制部分患者重复输注细胞后的细胞持久性及治疗效果。

本临床研究中观察到的中度不良事件，可能与改良的淋巴细胞清除方案以及细胞输注后未给予IL-2有关。与既往TCR-T细胞治疗中采用的淋巴细胞清除方案相比，本研究中患者接受了减量的环磷酰胺和氟达拉滨，该方案可有效清除淋巴细胞和单核细胞，但对中性粒细胞、血小板及血红蛋白影响较小，从而降低了治疗期间感染风险。此外，本研究未观察到3级或4级CRS及神经毒性。尽管IL-2常被用于基于TCR的过继性免疫治疗之后，但其在人体中是否必需、以及对细胞治疗疗效的具体影响尚不明确。虽然高剂量IL-2或低剂量IL-2可能有助于TCR-T细胞在体内的持续存留，但另有研究未予患者IL-2，仍观察到客观肿瘤退缩及T细胞在体内长期存留。本研究未使用IL-2，旨在最大限度降低毒性，并评估在无外源性IL-2支持条件下，本TCR-T细胞疗法的治疗潜力。鉴于部分患者在首次细胞输注后，TCR-T细胞在体内持续存留超过1个月甚至更久，IL-2似乎并非维持其存留所必需，尽管它可能增强TCR-T细胞的功能与疗效。

在既往一项研究报告中，2名转移性胰腺癌患者接受了经基因工程改造的自体T细胞治疗，这些T细胞表达两种受HLA-C*08:02限制、可识别KRAS G12D突变的TCR。其中一名患者获得客观的PR，另一名患者仅实现短期疾病稳定；2名患者在细胞输注后数月内外周血中均维持了较高水平的T细胞持久性。在近期一项临床研究中，7例转移性结直肠癌患者接受自体个体化新抗原反应性TCR-T细胞治疗后，有3例依据RECIST标准达到客观PR，包括肝、肺及淋巴结等多处转移灶的缩小，缓解持续时间为4至7个月。在另一项临床研究中，采用非病毒精准基因编辑技术制备的自体个体化新抗原反应性TCR-T细胞用于治疗16例不同类型难治性实体瘤患者，未观察到任何客观临床缓解；这可能部分归因于输注的TCR-T细胞数量相对偏低，范围为2.0×10⁸至5.4×10⁹，中位数为1.3×10⁹。在本研究中，5例复发性胰腺癌患者接受TCR-001工程化T细胞首次输注后，其中1例获得客观CR，其4处肝转移病灶完全消退，缓解持续达5.5个月。本研究中5例患者所输注的TCR-001工程化T细胞数量介于15.2×10⁹至17.2×10⁹之间，中位数为17.1×10⁹。3例患者（Pt.006、Pt.007与Pt.008）体内T细胞可持续存在一个月以上，且未表现出耗竭表型。尽管T细胞表型良好，但患者在首次细胞输注后即使联合多次PD-1抗体给药，仍未出现应答；提示疗效缺失并非源于T细胞植入不足或表型欠佳，而可能与其他因素有关，例如T细胞向肿瘤组织浸润障碍、肿瘤微环境免疫抑制过强，或TCR-T细胞对肿瘤细胞识别能力低下等。尽管此前的临床前研究发现，经TCR-001基因改造的T细胞能够识别并杀伤源自患者Pt.007原发肿瘤的胰腺癌类器官细胞（PAC-229），但在体内，TCR-001对肿瘤的识别能力可能仍不足以激发有效的抗肿瘤活性，从而未产生临床应答。未来，可通过为TCR-T细胞“加装”IL-7/CCL19、显性负向突变型TGFβRII等分子，或其它功能分子，以增强其效力，从而有望克服T细胞向肿瘤浸润不足或肿瘤免疫抑制微环境等缺陷。在患者Pt.003、Pt.006和Pt.007中，重复输注TCR-001或4148 TCR基因改造的T细胞均未带来客观临床应答。这些病例中观察到T细胞存续时间较短，并有证据表明TCR-T细胞遭到了超急性排斥反应。在患者Pt.006接受第二次4148 TCR基因改造T细胞治疗时，虽观察到该T细胞在体内持续存在，但仍未出现客观临床应答。值得注意的是，TCR-001与4148 TCR均可特异性识别呈递于HLA-A*11:01上的KRAS G12V8-16新抗原表位（长度为9个氨基酸），且最低识别浓度分别低至10ng/mL和1ng/mL。4148 TCR的功能亲和力似乎略强于TCR-001；发现，在识别并杀伤天然表达KRAS G12V突变及HLA-A*11:01的胰腺癌类器官方面，经4148 TCR转导的T细胞强于经TCR-001转导的T细胞。鉴于目前仅在再治疗情境下评估了4148 TCR，若将其作为首疗程细胞治疗进行疗效评估，将颇具意义。此外，结合HLA-A*11:01的10肽KRAS G12V 7-16新抗原表位在癌细胞表面的表达水平高于9肽表位，因而该10肽可能成为更具吸引力的靶点。

在一项研究中，T细胞的持续存留与TCR-T细胞治疗的临床疗效呈正相关。TCR-T细胞的持续存留可能受到多种因素影响，包括淋巴清除、IL-2输注、T细胞扩增、T细胞分化状态以及TCR亲和力。在Pt.003的第三次细胞输注过程中未实施淋巴清除，这与其外周血中TCR基因工程化CD8 T细胞峰值比例显著降低及T细胞存留时间较短相一致，进一步支持了淋巴清除对TCR-T细胞持续存留的重要性。在本研究中，体内长期存留的TCR基因工程化CD8 T细胞主要为干细胞样记忆T细胞（Tscm）亚群，这可能源于输注产品中Tscm亚群比例相对较高（约20%-50%）。考虑到这些细胞经历了两次体外扩增且培养时间长达20-30天（中位数为26天），输注产品中Tscm细胞比例偏高实属意外。多数细胞产品采用含Cell-Vive血清替代物的TheraPEAK X-Vivo 15培养基制备，该培养基可能有助于维持较低分化程度的T细胞亚群比例，但此推论尚待正式验证。尽管如此，观察到，在完成初次刺激、转导及扩增阶段后，TCR-T细胞中Tscm细胞比例高于最终输注产品，提示快速扩增步骤会促进T细胞向更成熟表型分化，这一现象亦见于近期一项临床研究。未来，可通过增加初始PBMC数量并省略第二次刺激（即快速扩增）步骤，来制备富含低分化T细胞的输注产品。尤为重要的是，发现部分患者在多次细胞输注后T细胞持续性较差，很可能由靶向抗KRAS G12V TCR的抗体所介导的超急性排斥反应所致。并非所有患者均产生针对异源TCR的抗体；因此，若计划重复给予TCR-T治疗，应在再次治疗前检测患者血浆中是否存在具有破坏性的抗小鼠TCRβ恒定区抗体及抗人TCR Vβ抗体。为进一步减轻TCR-T细胞的超急性排斥反应，可考虑联合应用B细胞耗竭剂（如利妥昔单抗）或CD19-CAR-T细胞，但该策略尚未开展临床验证。此外，还可更换为另一种TCR；若初治时使用的是人-鼠嵌合TCR，则再治疗时可改用另一种全人源TCR，本研究即采用了该策略。尽管将外源TCR导入原本表达内源性TCR的T细胞可能导致混合TCR二聚体形成，并在小鼠模型中引发有害甚至致死性的自身免疫反应，但在本研究受试者中并未观察到此类现象，这与既往人类TCR基因治疗的临床经验相符。为减少混合TCR二聚体的形成，在人4148 TCR α链与β链的恒定区引入两个点突变，以促进其通过二硫键形成特异性配对。未来，还可借助CRISPR/Cas9等基因编辑技术敲除内源性TCR，从而进一步降低因混合TCR二聚体引发自身免疫反应的潜在风险。

在一项早期研究中，48例患者治疗后血清中有6例（23%，共26例）检出针对经小鼠TCR转导的淋巴细胞的人抗小鼠TCR可变区抗体。这些抗体既见于治疗有反应的患者，也见于无反应的患者。相比之下，另17例接受全人源抗MART-1 TCR-T细胞治疗的患者经类似筛查，其治疗后血清中均未检出针对人源MART-1 TCR转导淋巴细胞的IgG结合活性。在一项近期纳入7例患者的临床研究中，8例采用含小鼠TCR恒定区的个体化自体新抗原反应性TCR进行治疗，其中1例无治疗反应的患者（编号4293）在治疗后第141天的血清样本中检出anti-TCR IgG抗体。尽管该患者体内anti-TCR IgG抗体所识别的确切表位尚未明确，但现有证据提示TCR可变区至少部分参与了识别过程：该血清仅微弱结合另外4种含小鼠恒定区的TCR转导T细胞中的2种。在本研究中，5例接受人-鼠嵌合TCR-001工程化T细胞治疗的患者中，有2例（Pt.003和Pt.007）产生了抗小鼠TCRβ恒定区抗体及抗人TCR Vβ抗体；而3例接受全人源4148 TCR工程化T细胞治疗的患者中，有1例（Pt.007）检出抗人TCR Vβ抗体。本研究中观察到的anti-TCR抗体发生率看似较高，可能源于以下因素的差异：淋巴清除方案强度（本研究强度较低）、转基因TCR固有的免疫原性（例如与患者HLA基因型相关）、用于检测anti-TCR抗体应答的血清/血浆样本采集方法及时间点，以及其他可能影响免疫状态的患者相关因素，如年龄、总体健康状况及既往治疗史等。本研究首次证实：所用TCR-T细胞产品中既含小鼠TCR恒定区，又含人TCR Vβ可变区，而患者体内可产生同时针对这两类结构的有害抗体应答。

综上所述，本临床试验数据显示，自体HLA-A*11:01限制性KRAS G12V反应性TCR-T细胞过继转移治疗安全可行，并在5例表达突变型KRAS G12V的晚期胰腺癌且HLA-A*11:01阳性的患者中，使其中1例获得了客观缓解。对于拟接受同种细胞产品再次治疗的患者，应评估其在首次细胞输注后是否产生了针对治疗用TCR的抗体，因该抗体可能导致细胞被排斥。

本研究存在若干局限性。首先，样本量较小是主要局限之一，这限制了研究结果的普适性与统计效能。因此，尚需纳入更多患者以进一步明确本KRAS G12V反应性TCR-T细胞产品的疗效。其次，患者间治疗方案存在一定差异，例如细胞输注数量、输注次数、抗PD-1药物剂量以及是否采用淋巴细胞清除方案等，未来需对这些变量加以更严格的控制。第三，针对TCR-T细胞治疗产生应答或无应答的内在机制，尚未开展系统性探索，有待后续深入研究。

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