抗体筛选效率低？单B细胞抗体制备技术详解

单克隆抗体由单一 B 淋巴细胞克隆产生的、氨基酸序列与空间构象完全均一的免疫球蛋白。其核心特征是能专一识别并结合抗原分子上的单一抗原决定簇，具有特异性强、批次间差异小、可规模化生产的特点，是生物制药、精准诊断及生命科学研究的核心工具。

一、单克隆抗体制备方法

目前对于单克隆抗体的开发一共有3大技术路线，一是传统的杂交瘤技术平台，该技术筛选的是抗体分泌型浆B细胞（Plasma B cells）；二是噬菌体展示技术，该技术直接对B细胞进行测序和建库，抗体序列来源可以是浆细胞也可以是记忆细胞（Memory B cells）；三是基于单B细胞直接测序或者基于B细胞体外培养筛选后测序技术，该技术抗体序列来源可以是浆细胞也可以是记忆细胞。每种方法都具有独特的优势和应用，本期重点讲解单B细胞抗体筛选技术。

二、单B细胞制备抗体流程

图一：详细实验流程

(I) B细胞分离
第一阶段旨在分离专门针对所选抗原的单个B细胞。为此，单个B细胞被荧光标记的抗原(蛋白质、病毒粒子或表达抗原的细胞)染色并分类到多孔板中。图一中，通过密度离心法从外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC），然后用磁珠富集B细胞，并用荧光标记的诱饵蛋白进行单细胞分选，分选至 96 孔板中。

(II) PCR扩增
第二阶段进行逆转录，然后在嵌套或半套式多引物聚合酶链式反应中扩增自然配对的重链和轻链，可以通过测序分析扩增的重链和轻链，以鉴定克隆关系并从分离的B细胞中推断出谱系特征。聚合酶链式反应引物的选择至关重要，因为它们需要覆盖所有不同的V基因片段，不能在编码V区引起突变，并且需要兼容以进行多路复用。

(III) 克隆
第三阶段在克隆阶段，第一阶段的聚合酶链式反应产物在克隆聚合酶链式反应(第三阶段)中用计算优化的引物混合物进行扩增，以将悬垂部分添加到哺乳动物表达载体中，并转化到大肠杆菌中，对于每条链，挑选单个克隆并用于接种96孔板液体培养和菌落PCR反应混合物，对菌落PCR进行测序分析，确定正确插入的可变区，并在液体培养中添加甘油进行长期保存。

(IV) 抗体生产
对于高通量或大规模抗体生产，正确克隆的液体培养物或甘油库存用于接种96孔小型(高通量)或摇瓶中尺度(大规模，低通量)细菌培养物，在高通量方案中，用96孔格式的质粒-DNA隔离柱制备DNA，并以48孔或96孔格式转染HEK293T细胞，上清液可直接用于下游分析，如酶联免疫吸附试验或微量中和分析，无需进一步纯化。为了规模化生产，将重链和轻链的中型DNA导入HEK293-6E细胞，通过蛋白G亲和纯化纯化单抗，用于下游检测。

重组兔单B细胞抗体服务流程