APOE+肿瘤相关巨噬细胞在肝癌免疫微环境中研究

《APOE deficiency triggers anti-tumour activity of macrophages in liver cancer》的研究发表于Nature子刊 Cancer Gene Therapy，由浙江中医药大学夏欣彤等人完成，系统性地探讨了APOE+肿瘤相关巨噬细胞在肝癌免疫微环境中的作用及其作为免疫治疗新靶点的潜力。

实验背景：

肝细胞癌是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，免疫检查点抑制剂治疗在部分患者中效果有限。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞 在促进肿瘤进展、血管生成、纤维化及免疫抑制中发挥关键作用。TAMs具有高度异质性，不同亚群功能各异，目前缺乏统一、可重复的亚群定义。APOE 在多种肿瘤中表达异常，并与免疫细胞浸润、胆固醇代谢等密切相关，但其在肝癌TAMs中的具体作用尚不明确

研究思路：

（一）研究目的：鉴定肝癌中关键的免疫抑制性巨噬细胞亚群及其临床意义

实验方法:

• 对多个公共数据库（GSE140228, CNP000050, GSE138709）的肝癌单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行整合与再分析。

• 使用Seurat和Harmony软件进行细胞分群、差异表达基因（DEGs）鉴定和批次效应校正。

• 利用TCGA-LIHC队列进行生存分析。

• 通过免疫荧光（IF）染色在人类肝癌组织标本中验证蛋白表达。
  

主要发现:

• 发现了一个在肿瘤组织中富集、特征为高表达APOE的巨噬细胞亚群（APOE+ TAMs）

• APOE+ TAMs的基因特征与肝癌患者的不良总生存期显著相关

• 在免疫检查点阻断（ICB）治疗无应答者的肿瘤中，APOE+ TAMs的丰度更高

图 1 APOE is upregulated in TAMs in liver cancer

（二）研究目的：解析APOE+ TAMs的功能特性与潜在作用机制

实验方法:

• 基因集富集分析（GSEA）和基因集变异分析（GSVA）探究APOE+ TAMs的生物学通路

• 使用SCENIC分析推断调控APOE+ TAMs的关键转录因子

• 用小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6的条件培养基（TCM）体外诱导骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），模拟TAMs表型

• 通过qPCR、免疫荧光和胆固醇检测试剂盒评估APOE、胆固醇代谢相关基因（Abca1, Abcg1）的表达和细胞胆固醇含量

• 使用siRNA敲低BMDMs中的Apoe基因，验证其功能

实验结果:

• APOE+ TAMs显著富集于脂质代谢和胆固醇外排通路

• 鉴定出NR1H3（LXRα）是APOE+ TAMs中活跃的关键转录因子

• TCM能成功诱导BMDMs高表达Apoe，并增强其胆固醇外排能力（表现为Abca1/Abcg1上调，总胆固醇含量下降），该效应在Apoe敲低后被削弱

（三）研究目的：验证APOE+ TAMs在体内对肿瘤生长和CD8+ T细胞功能的影响

实验方法:

• 构建小鼠皮下荷瘤模型：将Hepa 1-6细胞与对照（scramble）或Apoe敲低（siApoe）的BMDMs共同注射

• 使用流式细胞术和免疫荧光染色分析肿瘤内免疫细胞浸润

• 通过免疫组化（IHC）检测Ki67（增殖标志）（S0B2332）和TUNEL染色（凋亡标志）评估肿瘤生长状态

实验结果:

• 与对照组相比，注射Apoe敲低BMDMs的小鼠肿瘤生长显著减缓

• Apoe敲低组肿瘤中CD8+ T细胞的浸润显著增加，而CD4+ T细胞无显著变化。

• Apoe敲低组肿瘤细胞增殖（Ki67+）减少，凋亡（TUNEL+）增加

图 2 APOE+ TAMs inhibit HCC tumour growth through the immunomodulation of CD8+ T cells.

（四）研究目的：探究APOE+ TAMs导致ICB抵抗的细胞间通讯机制

实验方法:

• 对ICB治疗应答者与非应答者的scRNA-seq数据（GSE206325）进行细胞互作分析（CellChat）

• 体外将T细胞与对照或Apoe敲低的BMDMs共培养，通过qPCR检测T细胞耗竭标志物（Pdcd1, Lag3, Tim3）的表达

• 用胆固醇直接处理T细胞，观察其对耗竭标志物表达的影响

实验结果:

• 在非应答者中，APOE+ TAMs与CD8+ T细胞（尤其是耗竭亚群）的通讯增强，涉及MIF、GALECTIN-9、CXCL12等信号通路

• 与Apoe敲低的BMDMs共培养后，T细胞的耗竭标志物表达下降

• 外源性胆固醇处理可诱导T细胞表达耗竭标志物
  
  

图 3 APOE+ TAMs are enriched in ICB non-responder tumours.

（五）研究目的：评估靶向APOE与抗PD-1联合治疗的潜力

实验方法:

• 构建c-Myc/NRASV12诱导的免疫耐受型小鼠自发性肝癌模型

• 将小鼠分组，分别施用：对照剂、抗PD-1抗体、APOE抑制剂（COG133TFA）、抗PD-1+APOE抑制剂

• 通过H&E染色统计肝肿瘤结节数量和大小，通过IF和IHC分析CD8+ T细胞浸润、细胞凋亡和增殖

实验结果:

• 单用抗PD-1疗效有限，单用APOE抑制剂有轻微效果。

• 抗PD-1与APOE抑制剂联合治疗表现出显著的协同效应，能最有效地抑制肿瘤生长、减少肿瘤结节、促进CD8+ T细胞浸润、增加肿瘤细胞凋亡、抑制增殖

图 4 APOE inhibitor enhances the ICB efficacy of HCC.