RNA 表达研究通关秘籍：三步法实操指南

在分子生物学实验室里，RNA表达分析堪称“基础中的基础”，从基因功能验证到疾病标志物筛选，几乎都离不开它的身影。但不少科研人都曾踩过坑：提的RNA降解严重、逆转录效率忽高忽低、荧光定量结果重复性差……其实，搞定这些问题的关键，就藏在TriiZol裂解提取、逆转录合成cDNA、荧光定量PCR（qPCR）检测这“三件套”里。今天就带大家吃透这套黄金组合的操作精髓，让你的RNA表达研究一路绿灯！

第一关：TriiZol法提取RNA——守住实验的“源头活水”

RNA天生“娇弱”，易被核酸酶降解，而TriiZol试剂凭借强大的裂解能力和核酸酶抑制效果，成为提取总RNA的“王牌选手”。无论是动物组织、植物样本还是细胞，它都能轻松应对，帮你拿到高质量RNA。

TriiZol标准操作PROTOCOL

1. 样本处理

组织样本：

TriiZol用量：每 50-100 mg 组织加 1 ml TriiZol，样品体积不应超过TriiZol体积的10％。

（1）将动物或植物组织切成小块，在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理。

（2）将研磨好的组织粉末快速转入装有1 ml TriiZol 的 2 ml 离心管中，在涡旋振荡器上迅速振荡混匀，置于冰上，待所有的样品研磨完。

（3）裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等，匀浆后仍会存留有不溶物质，可于 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，然后吸取上清至一新的离心管中。

 细胞样本：

（1）贴壁细胞：吸尽培养液，每 10 cm2培养面积（6 孔板单孔或 35 mm 平皿）加入 1 ml TriiZol，用加样器吹打数次，以确保细胞完全裂解，然后转移至离心管中。

注：TriiZol 的使用量应由培养皿表面积决定，而非由细胞数目决定。TriiZol量不足可能导致提取的RNA中有DNA污染 。

（2）悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每5-10×106动植物或酵母细胞，或每1×107细菌细胞加入1ml TriiZol，用加样器吹打，使其完全裂解，然后转移至离心管中。

 注：添加 TriiZol 前切勿洗涤细胞，以免 RNA 降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞。

2．液相分离

（1）裂解产物于室温放置5 min，使核酸-蛋白复合物完全分离。（注：此时样品可在-80℃长期保存。）

（2）每 1 ml TriiZol 加入 0.2 ml 氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡 15 s，室温放置 2-3 min。

（3）4℃ 12,000 × g 离心 15 min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相(蛋白)，中间层（DNA）和无色的上层水相。

（4）吸取含总RNA 的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所用TriiZol试剂的 60％。

注：转移水相时切勿触及中间层，否则可能导致基因组DNA污染

3． RNA 回收

（1）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入0.5 mL 异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置10 min。

（2）4℃ 12,000 × g 离心 10 min，弃除上清，可见胶状的RNA沉淀。

（3）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入1 ml 75%乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀。

（4）4℃ 12,000 × g 离心 5 min，弃除上清。

（5）室温倒置5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥离心机，以免RNA过干，难以溶解）。

（6）加入适量（如 25ul）DEPC-ddH2O 或TE缓冲液，用加样器吹打数次溶解 RNA。

（7）通过 RNA 电泳以及紫外分光光度计检测，确定 RNA 的浓度、纯度和完整性。

（8）所得的 RNA 应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融。

注意事项：

1、如果需要测量 RNA 的 A260/A280 的比值，建议使用RNA定量缓冲液对样品稀释后，进行测量。

2、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无 RNA酶污染。耐高温器物可 180℃烘烤 4 小时以去除RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考虑用 0.01%的 DEPC 水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。加 0.01% DEPC 至重蒸水或 MiliQ 级水中，处理过夜，灭菌即成 DEPC 水。

3、使用冻存的细胞或组织抽提总 RNA 的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的 RNase 会被释放出来并剪切样品。如果不能及时抽 RNA， 推荐先加入适量 TriiZol，并裂解样品后冻存。

4、必须戴一次性手套操作，且尽量不要对着 RNA 样品呼气或说话，以防 RNA 酶污染。建议戴一次性口罩操作。

5、TriiZol 含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触 TriiZol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。

6、为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。

第二关：逆转录合成cDNA——搭建RNA到qPCR的“桥梁”

RNA无法直接用于PCR扩增，逆转录过程就是将RNA模板合成为稳定的cDNA，这一步的效率直接决定了后续定量结果的准确性。选择合适的逆转录试剂盒，并严格控制反应条件，是成功的关键。

逆转录一管化三代预混液标准操作PROTOCOL

1． 冰上配制如下反应体系： 

a. 推荐使用已去除基因组DNA污染的高质量RNA作为模板。

2.轻柔吸打混匀，瞬离；

3.55℃温育 15 min；注：若目标 RNA 不含 Poly(A) 结构，可预先 25℃温育 10 min。

4. 反应结束后，85℃温育 5 min 以终止反应；

5. 将获得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验；或立即保存于-20℃。

注意事项：

预混液中已经包含 Oligo(dT)20VN 和随机引物，不仅适用于包含Poly(A) 结构的真核生物mRNA，也适用于不含Poly(A) 结构的原核生物 RNA、真核生物rRNA 和 tRNA等模板，但不适用于miRNA 等小RNA模板。

第三关：荧光定量PCR——精准量化的“终极武器”

荧光定量PCR通过实时检测扩增过程中的荧光信号，实现对cDNA的定量分析，是评估基因表达水平的金标准。要获得可靠结果，需兼顾体系配制、程序设置和结果分析三大要点。

SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit标准操作PROTOCOL

一、实验须知：

1. SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit是针对两步法反应开发，变性步骤在95℃下进行，退火/延伸综合步骤在60℃下进行，同样适用于Tm低于60℃的引物；

2. 为确保采用SYBR Green进行Real-Time PCR时具有最高效率，产物长度建议为60-200bp；

3. PCR反应时必须先进行热启动步骤，即在95℃下孵育2min，激活热启动DNA Polymerase；

4. 对于96孔模块PCR仪，建议的反应物终体积为20µL。对384孔模块PCR仪，建议的反应物终体积为10µL。

二、操作步骤：

1. 将2×SYBR Advanced qPCR SuperMix、模板gDNA或cDNA、引物、ROX Reference Dye（根据需要）以及RNase-Free Water解冻并混匀，根据下表制备反应混合液。由于存在热启动机制，构建反应或设置实时定量PCR仪时，无需将样品一直放置在冰上。

2. 充分混匀反应混合物，并取适当体积加入PCR管或反应板中。

3. 将模板gDNA或cDNA（≤100ng/次）加入含有反应混合液的各个PCR管或孔中。对于两步法RT-PCR，加入的cDNA（未稀释的反转录反应物）体积不能超过PCR终体积的10%。

4. 根据下表中列出的程序设置实时定量PCR仪。应在进行退火 / 延伸步骤时收集数据。

*注意：

1、熔解曲线分析是实时定量 PCR 仪软件内置的一项分析步骤。进行此分析时，须遵守仪器提供的说明。

2、如果 PCR 仪无法在这么短的时间内完成数据采集，则以仪器采集数据所需的最短时为准。

3、该温度也同样适用于所有Tm低于60℃的引物。

4、循环数取决于模板DNA的量。

5、将 PCR 管或反应板放置在实时定量PCR仪上并启动PCR程序。

6、对 PCR 产物进行熔解曲线分析。

此项分析功能已内置于实时定量 PCR 仪的软件中，我们强烈建议您定期进行此项分析以验证 PCR 产物的特异性。

技术指标：

ROX Reference Dye可加入到2×SYBR Advanced qPCR SuperMix中以便长期储存。

高ROX Reference Dye机型：ABI Prism7000/7300/7700/7900HT/ 7900HT Fast和ABI Step One /ABI StepOne Plus等；

低ROX Reference Dye机型：ABI Prism7500/7500 Fast/ViiA7/ QuantStudio 3/5/6 /7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P系列，MJ Research Chromo4，Opticon (II) ，Corbett Rotor Gene 3000等；

无需加ROX Reference Dye机型：Thermal Cycler Dice Real Time System，Corbett Rotor-gene6000，Bio-Rad CFX系列，Roche LightCycler® 480，Qiagen Rotor-Gene Q，Analytik Jena qTOWER系列等。

RNA表达研究的成功，离不开三件套的环环相扣：TriiZol提取的高质量RNA是基础，逆转录的高效转化是桥梁，荧光定量的精准扩增是核心。掌握了这套TriiZol +逆转录+荧光定量的操作指南和注意事项，你就能轻松应对RNA表达分析中的各种难题。一套靠谱的试剂组合+规范的操作流程，就是你科研路上的“神队友”，帮你高效获得可靠数据，加速科研成果落地！