蛋白磷酸化检测：为何要同时“看”见总蛋白与磷酸化蛋白？

在生命科学的宏伟图景中，蛋白质就如同这台机器的精密部件，它们执行着细胞内几乎所有的生命活动，从信号传递、物质运输到能量产生，无一不包。而蛋白质磷酸化一种蛋白翻译后修饰（PTM），指在蛋白质激酶的催化下，将三磷酸腺苷（ATP）γ位的磷酸基团转移至蛋白质的特定氨基酸残基（主要为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）的过程。这一过程可逆，由磷酸酶催化去磷酸化。蛋白磷酸化则是蛋白质功能调控中最常见、最关键的机制之一，堪称生命活动的“开关“。 WB实验是最常见的蛋白质磷酸化检测方式，那在具体研究中我们该如何把控总蛋白和磷酸化蛋白的检测呢？

图 1 蛋白磷酸化机制

一、为什么检测总蛋白？

1. 量化蛋白质表达水平：

①整体丰度评估：总蛋白检测可以告诉你某个特定蛋白质在细胞、组织或生物样品中的整体数量。这对于了解基因表达的产物水平非常重要

②作为对照：当检测磷酸化蛋白时，总蛋白水平的稳定或变化可以帮助你判断观察到的磷酸化变化是由于蛋白质数量的改变还是磷酸化状态的改变

③样品加载量标准化：在进行Western Blotting等技术时，通常会使用总蛋白含量作为标准，以确保不同样品之间的蛋白质上样量一致，从而使得蛋白丰度的比较更加准确。

④初步筛查：在探索性研究中，检测总蛋白可以快速了解一组基因的表达情况，为进一步深入研究提供方向

2.确认特定蛋白质的存在：

验证表达：使用针对特定蛋白质的抗体进行WB 实验，可以确认该蛋白质在样品中是否存在。确定蛋白存在之后，才能进行下游的实验

3.作为其他分析的基线：

①蛋白质组学研究：在复杂的蛋白质组学分析中，了解总蛋白组成有助于理解样品的全貌。

②功能研究：蛋白质的丰度是其发挥功能的基础。如果某个蛋白质的总量显著下降，即使其磷酸化水平不变，其功能也可能受到影响。

二、为什么要检测磷酸化蛋白？

1.揭示信号转导通路：

①激活/失活状态：磷酸化通常是激活或失活蛋白质功能的关键步骤。检测特定位点的磷酸化水平，可以判断下游信号是否被激活

②信号级联：许多信号通路是通过一系列蛋白质的顺序磷酸化来传递信息的。检测通路中关键激酶及其底物的磷酸化状态，可以追踪信号的传递过程

③动态调控：磷酸化是一种高度动态的修饰，可以快速响应细胞内外环境的变化。检测磷酸化蛋白能够捕捉这种瞬时的信号变化

2.理解蛋白质功能调节：

①改变活性：磷酸化可以改变蛋白质的酶活性、与其他蛋白质的结合能力、亚细胞定位等

②参与细胞过程：细胞周期调控、细胞生长、凋亡、免疫应答、代谢等几乎所有重要的细胞过程都受到磷酸化蛋白的调控

3.识别疾病生物标志物：

①异常磷酸化：许多疾病，尤其是癌症，与异常的蛋白磷酸化模式有关。异常磷酸化可能导致细胞生长失控、信号传导异常。

②药物靶点：许多药物（如激酶抑制剂）就是针对异常磷酸化过程中的关键激酶或磷酸化蛋白设计的。检测这些蛋白的磷酸化状态可以评估药物的疗效或监测耐药性。

三、总蛋白与磷酸化蛋白：为何必须“并驾齐驱”？

既然磷酸化如此重要，为什么我们不能只检测磷酸化蛋白，而要同时检测总蛋白呢？这里面大有学问，并且具有不可替代的重要性：

1.确立“基线”：总蛋白是参照系，没有它，磷酸化就没有意义

磷酸化水平是相对于总蛋白水平而言。总蛋白比作一辆汽车的总零件数量，而磷酸化蛋白则像是那些被“激活”了某个功能（例如，引擎启动，刹车系统就绪）的零件。

①判断相对变化：如果我们只看到磷酸化蛋白的数量增加了，但不知道总蛋白的数量是保持不变、增加还是减少，我们就无法准确判断磷酸化蛋白的“相对丰度”。例如，如果总蛋白数量翻倍，而磷酸化蛋白数量也翻倍，那么磷酸化水平可能并没有实质性改变；但如果总蛋白数量不变，磷酸化蛋白数量翻倍，则说明磷酸化水平显著提高。总蛋白提供了一个必要的参照系，让我们能够准确地量化磷酸化蛋白的相对丰度，从而判断磷酸化事件的强度。

②排除假阳性/假阴性：有时，蛋白质的总表达水平本身就会发生变化。如果仅仅看到磷酸化蛋白水平的变化，而忽略了总蛋白的变化，我们可能会误判。例如，如果某种致病因素导致了某个靶蛋白的表达大幅增加，同时又导致其磷酸化水平升高，那么仅仅看到磷酸化蛋白的升高，可能只是反映了总蛋白表达的增加，而非磷酸化本身的异常激活。

2.探究表达调控与磷酸化调控的协同作用：生命调控的“双重奏”

总蛋白的表达水平本身就是一种重要的调控机制。细胞可以控制一个蛋白的产生量，也可以控制它的磷酸化状态，这两种调控往往是协同作用的。

①理解通路激活机制： 某些信号通路在激活时，会同时上调靶蛋白的表达和磷酸化。例如，在某些生长因子刺激下，细胞可能不仅会增加特定信号蛋白的产生，还会对其进行磷酸化激活。同时检测总蛋白和磷酸化蛋白，有助于我们理解这种“量”与“活”的协同调控机制，从而更全面地解析信号转导通路。

②区分不同层面的调控： 有时，一个疾病或生理过程的发生，可能源于蛋白质表达的异常，也可能源于磷酸化状态的异常，甚至两者兼有。通过同时检测，我们可以区分是蛋白“数量”不足/过剩导致了问题，还是蛋白“状态”不对（即磷酸化异常）导致了问题，从而更精确地定位病因和设计治疗策略。

3.评估磷酸化效率：理解“开关”的灵敏度

磷酸化反应的效率，即有多少总蛋白被磷酸化了，也是一个重要的生物学信息。

①评估激酶活性：磷酸化反应是由激酶催化的。通过比较磷酸化蛋白和总蛋白的水平，我们可以间接评估特定激酶的活性。如果总蛋白水平稳定，而磷酸化蛋白水平随时间推移而显著增加，则表明激酶活性很高。

②理解反馈机制：细胞内存在复杂的反馈调控机制。磷酸化状态的变化可能会影响蛋白的稳定性或其与其他蛋白的相互作用，进而影响其表达水平。同时检测两者，有助于揭示这些复杂的调控网络。

总结来说，检测总蛋白是为了了解蛋白质的“基础含量”，而检测磷酸化蛋白是为了了解蛋白质的“激活状态”和“功能调控”。这两种检测是相互依赖、互为补充的，是深入理解生命活动和疾病发生机制不可或缺的手段。结合总蛋白和磷酸化蛋白的检测结果，才能更全面地理解蛋白质的表达、状态和功能。