H9胚胎干细胞培养攻略

一、复苏要点

1、hESC/iPSC完全培养基配制

hESC/iPSC Basal Medium450 mL2℃~8℃，12个月

hESC/iPSC Grouth Supplements A50 mL-20℃ or -80℃，12个月

hESC/iPSC Supplement C（Y27632）1mL（5mM）-20℃ or -80℃，12个月

组分

500 mL

100 mL

50 mL

hESC/iPSC Basal Medium450 mL90mL45 mL

hESC/iPSC Grouth Supplements A50 mL10 mL5 mL

• 4°C下解冻A过夜，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。A冻融总次数不能超过2次，按5mL每管分装。

• 4°C下解冻C过夜，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。C冻融总次数不能超过2次，按100ul每管分装。Y27632只在复苏、传代的第一天使用，冻存使用。

• 参考表1，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完全培养基，4°C储存，2周内用完。完全培养基可分装-20 °C 下储存长达 6 个月。

• 使用前，完全培养基在室温下预热至不再感觉冰凉。

2、基质胶铺板（以包被6孔板为例）

• 将基质胶于4°C冰箱里的冰浴中过夜解冻。200ul、1mL枪头提前-20℃过夜预冷。

• 用4°C预冷的DMEM/F12将基质胶原液以1:100的比例进行稀释。例如：将1.5mL基质胶加入已含有150mLDMEM/F12的离心管中，包被量为300uL/cm²，6孔板每孔10cm²，每孔3mL，均匀铺开并完全覆盖培养板。剩余包被液4℃两周内用完。

• 将细胞培养板放置于培养箱预热。

• 将含有包被液的培养板在室温静置一小时。注意一定不要让包被过的培养板表面变干。

• 吸掉包被液，并在培养板上立即种上干细胞与培养基混合液。

3、复苏 hESC/iPSC（以 6 孔板为例）

• 将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（15~30℃）。

• 取3 mL hESC/iPSC完全培养基，加入6μL Supplement C终浓度为10uM，取9 mL含有Supplement C DMEM/F12，加入18 μL Supplement C使终浓度为10uM，恢复至室温（15~30℃）。注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。

• 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完全消失时取出（冰晶剩绿豆大小时）。

• 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL 含Y27的DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。

• 吸弃六孔板内的铺板液，将2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基靠壁缓慢加入六孔板孔中。

• 离心完吸弃上清，至留下 50uL 左右的上清，轻弹管底 3-4 下至细胞混匀在上清中，逐滴缓慢加入 1mL 含有 Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培养基，轻弹管底 3-4 下 混匀细胞，将这 1mL 细胞悬空滴加进 6 孔板的含有 Supplement C 的 hESC/iPSC完全培养基中。

• 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO₂浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。注：水平十字摇匀3次，左右两次+上下两次算一次

• 18-24小时后换新的hESC/iPSC完全培养基，之后每天更换培养基（6孔板，2mL/孔）。注：在hiPSC培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。

二、传代要点

1、条件和比例

图1. hESC/iPSC完全培养基连续培养hiPSC细胞形态图：（A）和（B）分别为hiPSC细胞培养第2和4天时低倍镜hiPSC培养形态图示，（C）和（D）为培养至第2和4天时的高倍镜hiPSC培养形态图。

（1）传代条件：

• 细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代；

• 细胞汇合度较高，集落变得过于密集或过大；

• 细胞集落分化增多。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。

（2）传代比例：

可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代。

• 如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(B-D)所示），建议按照1:10进行传代；

• 如果密度偏低，则可降低传代比例；

• 密度偏高，则增加传代比例。

注：1:10传代就是1个孔传10个孔（以6孔板为例）。

2、消化

图2：消化hiPSC细胞不同时间形态图：（A）消化5 min高倍镜hiPSC培养的的形态图;（B）消化6 min高倍镜hiPSC培养的形态图。

• 将 Matrigel 包被的6孔板，hESC/iPSC Passage Solution，DPBS提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。

• 根据传代接种的孔数准备2 mL/孔+1mL的hESC/iPSC完全培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，恢复至室温（~25℃）。

• 将孔内培养基吸弃，加入1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸弃。

• 加入1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完全覆盖孔底。

• 置于37℃培养箱中孵育5-6 min。

  注：① 消化5-6 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（＜10min）。② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。

• 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

• 及时吸取2 mL/孔预温的hESC/iPSC完全培养基+ Supplement C，快速轻柔吹打，利用枪头中的培养基吹打一次后，吸悬液再吹打一次，使细胞脱离基质。

  注：① 加hESC/iPSC完全培养基 + Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。② hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速，以及最好一次操作不要超过4孔（六孔板）。

• 吸弃6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完全培养基+ Supplement C 2 mL/孔。

• 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

• 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO₂浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。

• 18-24小时后更换新hESC/iPSC完全培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。