简单搞定 Bradford 蛋白定量！

1、前言

Bradford 法（考马斯亮蓝法）是蛋白含量测定的经典实验方法，因其灵敏度优异，被实验室广泛使用。但操作细节把控不当，容易出现结果不稳定、重复性差等问题。

本文为你带来源自 Springer Protocol 的标准化实验方案，稳定好做、易上手。

2、实验原理

Bradford 法以考马斯亮蓝 G-250 为显色染料。

在酸性环境中，染料可与蛋白质中的碱性氨基酸（组氨酸、精氨酸、赖氨酸等）结合，形成染料 - 蛋白复合物，溶液颜色由棕黄色变为蓝色，可用分光光度计进行检测。

蛋白浓度越高，蓝色显色强度越高，通过吸光度即可定量计算蛋白含量。

该方法操作简便、快速、灵敏度高，受缓冲液成分干扰小，是蛋白定量的优选方法。

此法仍存在一定局限性：显色反应依赖蛋白质中的组氨酸、精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸。若待测蛋白中这类氨基酸含量与平均水平差异较大，会导致定量结果不准确。

3、实验材料

所需设备

• 移液器

• 玻璃比色皿

• 紫外分光光度计

试剂与耗材

• 考马斯亮蓝 G

• 100% 乙醇

• 磷酸

• BSA（标准品，用于绘制标准曲线）

• 稀释缓冲液

• 待测蛋白样品

• 超纯水

• Whatman 1 号滤纸

Bradford 试剂配制

• 将 40 mg 考马斯亮蓝 G 溶于 20 mL 100% 乙醇，搅拌 20 min；

• 依次加入 40 mL 磷酸与 340 mL 超纯水；

• 用 Whatman 1 号滤纸对混合液过滤 2 次；

• 滤液转入棕色瓶，4 ℃ 避光保存。

注：全程操作需避光。

4、实验步骤

蛋白样品建议按需分装，单次使用一管，冰上解冻。

• 用 BSA 配制 1–20 μg 梯度稀释的标准品，在 595 nm 波长下检测吸光度并绘制标准曲线（下文提供标准配制方案）。



三列数据从左至右依次为：稀释缓冲液、Bradford 试剂、BSA 标准品。

• 根据已绘制的标准曲线，测定缓冲液与待测样品混合液在 595 nm 处的吸光度，对照标准曲线即可计算得到待测样品的蛋白浓度。

5、标准曲线绘制

以蛋白浓度（mg/mL）为 X 轴，595 nm 处吸光度（OD595）为 Y 轴，利用 BSA 标准品数据绘制标准曲线。为保证定量精度，建议对数据进行最优曲线拟合，示例见下图。



左侧为 BSA 标准品原始数据，右侧为基于该数据拟合得到的标准曲线。

6、注意事项

• Bradford 法灵敏度较高，适用于低浓度蛋白样本。若样品浓度超出检测线性范围，需先梯度稀释，使吸光度落在有效区间内再进行测定。

• 样品中含有的表面活性剂（如常见于总蛋白提取缓冲液）会对检测结果产生干扰，需尽量避免。

• 显色完成后应在 1 小时内完成吸光度检测，每组样品建议设置 3 个技术重复。

• 移液操作需精准规范。由于本法多用于低浓度蛋白定量，移液误差易导致结果波动，需严格控制操作一致性。

• 若待测蛋白中组氨酸、精氨酸、赖氨酸含量与常规蛋白平均水平差异较大，不建议使用 Bradford 法，可根据蛋白特性选择 Lowry 法、BCA 法或紫外分光光度法。