IL-33 通过自噬溶酶体途径特异性降解 GKN1

一、研究背景

慢性萎缩性胃炎以胃黏膜腺体萎缩和慢性炎症为主要特征，是消化系统常见疾病，也是胃癌演进的重要癌前病变。除幽门螺杆菌感染这一主要致病因素外，化学暴露、氧化应激及免疫功能紊乱等均参与CAG的发病过程。白细胞介素作为重要的免疫调控分子，在胃黏膜炎症反应和稳态维持中扮演关键角色。IL-33作为IL-1家族的新型成员，可通过其受体ST2介导上皮细胞与免疫细胞间的相互作用，参与多种炎症性疾病的发生发展，但目前其在CAG中的具体作用及调控机制仍不清楚。 细胞自噬是维持细胞内环境稳态的重要生物学过程，通过降解受损细胞器和异常蛋白参与细胞存活调控。近年来研究表明，自噬异常与胃黏膜病变密切相关，但自噬在CAG发生发展中的功能及调控网络尚未完全阐明。胃黏膜保护蛋白GKN1主要表达于胃上皮细胞，具有维持胃黏膜屏障完整性、抑制炎症反应等功能，其表达下调与胃黏膜损伤及癌变密切相关。本研究旨在明确IL-33在CAG中的表达特征、调控机制及其与自噬、GKN1的相互作用，为解析CAG的发病机制提供新视角。

Liu K, Huang H, et al. IL-33 Accelerates Chronic Atrophic Gastritis through AMPK-ULK1 Axis Mediated Autolysosomal Degradation of GKN1. Int J Biol Sci. 2024 Apr 8;20(6):2323-2338.

二、材料与方法

（一）实验动物与模型构建

构建CAG小鼠模型，分为野生型小鼠和IL-33基因敲除小鼠。通过原位注射靶向ST2的腺相关病毒构建ST2敲低小鼠模型。部分小鼠在建模期间给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）口服、自噬诱导剂雷帕霉素处理或ROS清除剂NAC干预。向小鼠腹腔注射重组IL-33蛋白模拟CAG样病变。

（二）细胞实验

采用人胃上皮细胞系GES-1，分别用幽门螺杆菌、化学致癌物MNNG刺激，部分细胞预处理ROS清除剂NAC或STAT3抑制剂。通过敲低AMPK、ULK1或STAT3基因，观察其对IL-33表达及自噬的影响。

（三）检测方法 

采用转录组测序分析CAG小鼠胃组织中白细胞介素家族表达谱；通过Western blot、免疫荧光染色检测IL-33、ST2、AMPK、ULK1、GKN1、自噬标志物（LC3B、p62）等蛋白的表达水平及定位；利用实时荧光定量PCR检测相关基因的mRNA表达；通过血清学检测分析胃蛋白酶原A（PGA）、胃蛋白酶原C（PGC）水平；采用磷酸化蛋白质组学分析IL-33刺激后胃上皮细胞的磷酸化蛋白变化。

三、研究结果

（一）IL-33在CAG中特异性高表达

转录组测序结果显示，在CAG小鼠胃组织中，IL-33是白细胞介素家族中表达上调最为显著的成员。Western blot和免疫荧光结果证实，CAG小鼠血清及胃组织中IL-33的蛋白水平显著升高，且主要定位于胃黏膜上皮细胞。而其受体ST2的表达在正常小鼠与CAG小鼠间无显著差异，提示IL-33在CAG中存在特异性高表达特征。

图1. IL-33是慢性萎缩性胃炎中表达最显著的白细胞介素

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（二）幽门螺杆菌/MNNG通过ROS-STAT3信号通路上调IL-33表达

幽门螺杆菌和MNNG刺激均可显著诱导GES-1细胞中IL-33的mRNA和蛋白表达，同时导致细胞内活性氧（ROS）水平升高。ROS清除剂NAC可有效抑制幽门螺杆菌或MNNG诱导的IL-33表达及其启动子活性。转录因子筛选实验表明，STAT3是介导这一过程的关键分子，幽门螺杆菌和MNNG可激活STAT3的磷酸化及其核转位，敲低或抑制STAT3则显著降低IL-33的转录与蛋白水平，证实幽门螺杆菌/MNNG通过ROS-STAT3信号通路调控IL-33表达。

图2. 幽门螺杆菌/MNNG通过ROS-STAT3信号通路诱导IL-33表达

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（三）IL-33/ST2信号轴促进CAG的发生发展

与野生型CAG小鼠相比，IL-33基因敲除小鼠胃黏膜的炎性细胞浸润减少，壁细胞丢失减轻，壁细胞标志物ATP4B表达升高；促炎因子TNF-α和IL-6表达下降，组胺H2受体水平恢复，血清PGA、PGC水平及其比值趋于正常。原位注射靶向ST2的腺相关病毒敲低ST2表达后，获得了与IL-33敲除一致的表型改善，表明IL-33通过其受体ST2介导CAG的病理进展。

图3. IL-33/ST2参与慢性萎缩性胃炎的发病机制

Liu K, Huang H, et al. IL-33 Accelerates Chronic Atrophic Gastritis through AMPK-ULK1 Axis Mediated Autolysosomal Degradation of GKN1. Int J Biol Sci. 2024 Apr 8;20(6):2323-2338.

（四）IL-33以AMPK-ULK1轴依赖的方式增强胃上皮细胞自噬

磷酸化蛋白质组学分析显示，IL-33刺激后胃上皮细胞中AMPK信号通路和自噬通路被显著激活。验证实验证实，IL-33可时间依赖性诱导AMPK和ULK1的磷酸化，同时增加自噬标志物LC3-II/I比值，促进p62蛋白降解和GFP-LC3斑点形成，表明IL-33可诱导胃上皮细胞自噬。该自噬过程不依赖新蛋白质合成，敲低或抑制AMPK、ULK1均可抑制IL-33诱导的自噬。体内实验显示，IL-33敲除或ST2敲低的CAG小鼠胃组织中，p-AMPK、p-ULK1及LC3B水平均显著降低。

图4. IL-33以AMPK-ULK1轴依赖的方式增强胃上皮细胞自噬

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（五）自噬促进CAG的病理进展

CAG模型小鼠口服自噬抑制剂3-MA后，黏膜炎症细胞浸润显著减轻，壁细胞数量增加，促炎因子表达下调，组胺H2受体上调，血清PGA、PGC水平及其比值恢复正常，且3-MA不影响AMPK和ULK1的磷酸化。相反，自噬诱导剂雷帕霉素可单独诱导壁细胞丢失，并在CAG模型中加剧炎症反应、降低血清胃蛋白酶原水平、增强LC3B表达，证实自噬在CAG中具有促病作用。

图5. 自噬促进慢性萎缩性胃炎的发展

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（六）IL-33通过自噬促进CAG发生

腹腔注射重组IL-33蛋白可诱导小鼠出现CAG样病变，包括炎性浸润增加、壁细胞减少、促炎因子升高、保护性受体下调及血清胃蛋白酶原水平降低。同时给予自噬抑制剂3-MA可显著缓解上述病变，并抑制IL-33引起的LC3B增加，但不影响AMPK和ULK1的磷酸化，表明IL-33的致病作用依赖于自噬激活。

图6. IL-33通过自噬促进慢性萎缩性胃炎

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（七）IL-33通过自噬-溶酶体途径特异性降解GKN1

IL-33可时间和剂量依赖性降低胃上皮细胞中GKN1的蛋白水平，但对GKN2、GKN3的蛋白水平及GKNs家族的mRNA表达无显著影响。进一步研究发现，IL-33可显著缩短GKN1蛋白的半衰期，溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1（BAF-A1）可阻断IL-33引起的GKN1降解，而蛋白酶体制剂MG132无此作用。免疫荧光共定位显示，IL-33刺激后GKN1与溶酶体标志物LAMP2的共定位增加。临床样本分析显示，CAG患者胃组织中IL-33蛋白表达升高，而GKN1表达降低，血清中也呈现IL-33升高、GKN1下降的趋势。

图7. 清除ROS通过降低IL-33表达和抑制自噬改善慢性萎缩性胃炎

Liu K, Huang H, et al. IL-33 Accelerates Chronic Atrophic Gastritis through AMPK-ULK1 Axis Mediated Autolysosomal Degradation of GKN1. Int J Biol Sci. 2024 Apr 8;20(6):2323-2338.

（八）清除ROS可通过降低IL-33表达及抑制自噬改善CAG

CAG模型小鼠使用ROS清除剂NAC后，壁细胞数量增加，炎症浸润减少，炎症因子谱改善，血清胃蛋白酶原水平恢复正常。机制上，NAC处理可抑制STAT3的活化，降低IL-33的表达，同时减弱AMPK-ULK1磷酸化和自噬标志物LC3B的形成，表明清除ROS可通过抑制IL-33表达及其下游自噬通路缓解CAG。

图8. IL-33通过自噬溶酶体途径促进GKN1降解

Liu K, Huang H, et al. IL-33 Accelerates Chronic Atrophic Gastritis through AMPK-ULK1 Axis Mediated Autolysosomal Degradation of GKN1. Int J Biol Sci. 2024 Apr 8;20(6):2323-2338.