BCA法蛋白质定量测定技术指南

一、蛋白质定量分析中的BCA法概述

   BCA法（二喹啉甲酸法）是一种广泛应用于溶液内蛋白质含量测定的分析技术。该方法基于特定的物理与化学反应，通过显色体系对蛋白质浓度进行定量评估，具有较高的准确性与重复性，已成为生物化学及分子生物学研究中常用的蛋白质定量手段。

   在生物体系统中，蛋白质不仅是细胞与组织结构的基本组成成分，也参与并调控各类生理生化过程。因此，对样本中蛋白质含量进行精确测定，是相关实验研究的重要基础。正常生理状态下，人体血液中蛋白质的浓度范围通常维持在60至80克/升之间。

   相较于其他定量方法，BCA法在操作上较为简便，且具备良好的灵敏度和线性范围，适用于多种样本类型的蛋白质含量测定。其原理主要依赖于碱性环境下蛋白质分子与二价铜离子的相互作用，以及随后与BCA试剂的显色反应，通过比色分析即可实现蛋白质浓度的可靠测定。因此，该方法在基础研究与实验分析中常作为首选的定量策略之一。

二、BCA法测定蛋白质含量的基本原理

   BCA法的定量基础在于二喹啉甲酸（BCA）这一稳定且具碱性的水溶性化合物。其作用机理主要包含两个连续发生的化学反应步骤。首先，在碱性介质中，蛋白质分子将试剂体系中的二价铜离子（Cu²⁺）还原为一价铜离子（Cu⁺）。随后，生成的一价铜离子与BCA分子发生特异性螯合，形成一种呈现蓝紫色的复合物。

   该复合物在562纳米波长处具有特征性吸收峰，其吸光度值与反应体系中蛋白质的浓度呈正相关。因此，通过测定反应液在562纳米处的吸光度，并参照已知浓度的标准蛋白质所建立的标准曲线，即可实现对样品中蛋白质含量的准确定量。

   此方法因检测灵敏度高、操作流程简便以及对多种常见干扰物（如缓冲液中的某些成分）耐受性较好等优点，在生物化学研究中应用广泛。需要注意的是，反应体系的孵育温度与时间等因素会对显色强度产生影响，因此优化并严格控制反应条件，是确保测定结果准确性与重复性的关键。

三、BCA法测定蛋白质含量的试剂配制

(一) BCA工作液的配制

本实验所需BCA工作液由试剂A与试剂B按比例混合而成，具体配制方法如下。

① 试剂A（1升）：
分别准确称取10克BCA（1%，w/v）、20克Na₂CO₃·H₂O（2%，w/v）、1.6克Na₂C₄H₄O₆·2H₂O（0.16%，w/v）、4克NaOH（0.4%，w/v）及9.5克NaHCO₃（0.95%，w/v）。将上述试剂依次溶解于适量蒸馏水中，完全溶解后定容至1升。使用NaOH溶液或固体NaHCO₃将溶液pH值精确调节至11.25。

② 试剂B（50毫升）：
准确称取2克CuSO₄·5H₂O（4%，w/v），加入蒸馏水溶解并定容至50毫升。

③ BCA工作液：
取50体积试剂A与1体积试剂B充分混合均匀，即为所需工作液。该混合试剂在适宜条件下可保持稳定约一周。

(二) 标准蛋白质溶液的配制

准确称取0.5克牛血清白蛋白（BSA），以蒸馏水溶解，并转移至100毫升容量瓶中定容，配制成浓度为5毫克/毫升的储备液。使用前，用蒸馏水或相应缓冲液将此储备液稀释10倍，获得浓度为0.5毫克/毫升的标准工作液，用于标准曲线的绘制。

四、BCA法测定蛋白质含量的操作步骤

 1. 加样准备
取96孔酶标板，按预先设计的实验布局，依次向各孔中加入标准品及待测样品。

 2. 显色反应
于每孔中准确加入20微升样品溶液，随即加入200微升预先配制的BCA工作液。轻轻振荡酶标板以确保反应液充分混匀。将酶标板置于37℃恒温箱中孵育30至60分钟，待反应完全后取出，冷却至室温。

 3. 吸光度测定
使用酶标仪，选择562纳米作为测定波长，以未加入蛋白质样品的BCA工作液孔作为空白对照，读取各孔的吸光度值。以系列浓度牛血清白蛋白（BSA）标准溶液的浓度为横坐标，对应测得的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

 4. 浓度计算
根据待测样品孔测得的吸光度值，在标准曲线上查得对应的蛋白质浓度。若吸光度值落在标准曲线线性范围之外，可适当稀释样品后重新测定，以确保结果准确性。最终计算结果可表示为克每升（g/L）或根据需要进行单位换算。

五、标准曲线绘制与浓度计算

 1、数据收集
分别测定系列浓度牛血清白蛋白（BSA）标准溶液（通常建议设置不少于6个浓度梯度）及待测样品的吸光度值。

 2、散点图绘制
将标准溶液的已知浓度（x轴）与对应的平均吸光度值（y轴）录入数据分析软件，生成XY散点图。

 3、标准曲线拟合
对散点图数据进行线性回归分析，添加趋势线并显示其线性方程及决定系数（R²值）。R²值用于评估数据点与拟合直线的接近程度，其值越接近1（通常要求≥0.99），表明线性关系越好，定量结果的可靠性越高。

 4、样品浓度计算
将待测样品的吸光度值代入上述线性回归方程，计算得出对应的蛋白质浓度。若样品经稀释处理，需在最终结果中乘以相应的稀释倍数。

六、蛋白质浓度测定实验的注意事项

为保障BCA法测定蛋白质浓度的准确性、重复性及可靠性，实验操作中需注意以下要点：

 1、标准品的配制与保存
标准品储备液可于-20℃条件下长期保存（建议不超过一年）。但每次实验时，必须使用新鲜配制的标准工作液绘制标准曲线，以避免因储存条件导致的标准品活性变化对定量结果产生影响。

 2、实验重复与数据处理
建议每个样品设置不少于三个技术重复，以评估实验的重复性。后续数据处理时，可依据统计学方法（如Grubbs检验法）识别并剔除异常值，从而提高最终结果的准确度。

 3、反应条件的控制
显色反应的强度受孵育温度与时间影响显著。为获得稳定的结果，应确保孵育过程在恒温（如37℃）及规定时间内完成。鉴于反应条件可能存在的细微波动，每次实验均需同步绘制全新的标准曲线。

 4、标准曲线的绘制
绘制标准曲线时，须明确设置坐标轴：横坐标（X轴）为标准蛋白质浓度，纵坐标（Y轴）为对应吸光度值。需确保数据点分布均匀并处于线性范围内，避免坐标轴误用导致的定量错误。

 5、加样操作的规范性
加样过程需精确、匀速，尽量避免产生气泡。若孔内出现气泡，可使用微量注射器针头轻轻戳破，或将酶标板置于微量振荡器上短暂轻摇，以使溶液混合均匀并消除气泡，防止其对吸光度读数造成干扰。

 6、吸光度的及时测定
显色反应完成后，应尽快将酶标板冷却至室温并在短时间内完成所有孔的吸光度测定。延迟测定可能导致反应产物不稳定，从而引入测量误差。

 7、样品的预处理
若预实验表明待测样品蛋白质浓度超出标准曲线线性范围，需使用适当的缓冲液（如磷酸盐缓冲液）对其进行梯度稀释，使稀释后样品的预期浓度落入标准曲线中部线性最佳区间，最后计算结果时乘以相应的稀释倍数。