文献分享：调节重轻链启动子优化CHO细胞中抗体高通量生产

背景

在过去的十年中，非天然单克隆抗体的数量呈指数级增长，这得益于双特异性抗体（BsAbs）和多特异性抗体的出现，这种主要序列的多样化对CHO生物制造平台提出了挑战。抗体序列的变化可能会对生产产生负面影响，通常会导致细胞生长不佳、特定生产率低和产品质量下降导致这些难以表达（DTE）抗体产量较低的因素包括折叠效率低下、组装不匹配、细胞内积累以及链聚集的形成等。CHO细胞中单克隆抗体（mAb）的生产取决于重链（HC）和轻链（LC）的平衡共表达等因素。HC和LC之间的不平衡会降低效价、损害产品质量并对细胞活力产生负面影响，这意味着在细胞系开发中应尽早确定最佳的LC/HC表达比。

2026年1月9日相关研究人员发表了一篇名为“High-throughput optimization of antibody production in CHO cells by tuning heavy- and light-chain promoter strength”的研究。该研究提出了一个高通量筛选平台，结合实验设计（DoE）策略，在过渡阶段确定最佳的LC/HC表达平衡。该平台提供了一种快速和可扩展的方法来定义抗体特异性LC/HC启动子强度组合，在不损害细胞健康的情况下最大化生产力，在致力于稳定的克隆生成之前实现更明智的构建选择。

高通量系统中的质粒生成与转染操作

CHO细胞中快速筛选LC/HC启动子强度比值，我们采用了单载体、96孔格式的高通量工作流程。从PCR和克隆/菌落PCR到miniprep、转染和抗体测定，所有步骤均在96孔板中进行。LC和HC转录单位之间插入了两个绝缘序列。

质粒组装分为两步。首先，分别构建携带CL和CH区域的填充质粒和骨架质粒，PCR扩增mAb特异性可变区（VL和VH）；其次，进行了四片段组装（CL、CH、VL、VH），以产生表达抗体B、C和E的最终LC-HC双盒结构，通过菌落PCR筛选组装成功，并通过跨连接和可变区的Sanger测序进行确认。对于每个LC/HC启动子条件和抗体，选择一个序列验证的克隆进行下游实验。快速构建27个质粒（3个抗体×9个LC/HC启动子组合）。在转染环节，系统在CHO-S细胞中实现了平均91%的高转染效率，确保了孔间的一致性与数据的可靠性。

用于瞬时单克隆抗体生产的最佳重轻链比

对于D最优定制设计的实验设计（DoE）方法，分析了三种不同的抗体序列，评估了两个分类因素（HC和LC）在三种表达水平（5、40和100 RPU）下的表现，并且有三个响应变量：活细胞密度（细胞/mL）、活力（%）和滴度（mg/L）。三种抗体（B、C、E）的最佳启动子组合各不相同：

抗体B：高LC +中HC（LC100-HC40）

抗体C：中LC +中HC（LC40-HC40）

抗体E：高LC +中HC（LC100-HC40）

说明最佳的轻链/重链启动子比例是依赖抗体的，每种抗体而言，最佳的HC/LC比率必须通过实验确定，因为序列特异性折叠动力学和组装效率塑造了为了最大化产量和保持细胞活力的理想表达平衡。

总结

这项工作展示了一个在微尺度上，通过DoE指导的平台，系统地通过在CHO细胞中调节启动子来优化抗体重链和轻链的表达平衡，有效地将构建设计和生物工艺开发集成到一个高通量的工作流程中。高通量的瞬时筛选能够快速评估多个构建体组合的表达性能，并早期识别最佳载体设计。这种综合方法允许在大约2个月内完成稳定细胞系的生成。相比之下，常规未优化工作流程依赖于基线载体设计，具有固定的启动子配置和表达参数。当识别出不理想的表现仅在稳定细胞系生成之后，才需要迭代的载体重新设计和重新克隆。需要重复细胞系开发周期，导致时间线大大延长（>6-12个月）。