293T细胞培养攻略

293 [HEK-293] 细胞是经人腺病毒5(Ad5)转染而形成的人胚肾细胞永生化细胞系，293细胞包含并表达转染的Ad5基因。293T细胞是293 [HEK-293] 细胞株插入了SV40 T-antigen的温度敏感基因形成的高转衍生株，广泛用于病毒包装，呈上皮样，贴壁，营养体系是DMEM+10% FBS。

293T细胞基本信息：

名称：293T [HEK-293T] （人胚肾细胞）

形态：上皮样

生长特性：贴壁

营养体系：DMEM+10% FBS+1% 双抗

图1 293T [HEK-293T] （人胚肾细胞）

一、首先我们讨论的是为啥293T细胞传代后聚团严重？如图2所示，背景贴壁细胞贴壁良好，形态正常，而黄色团块则是因为消化不当形成的细胞团，难以贴壁，并出现了成簇增殖。

图2 293T [HEK-293T] （人胚肾细胞）

这种情况多半是胰酶消化操作不当导致的细胞聚团：

1）消化过度或吹打过猛导致细胞受伤严重，破损的细胞碎片容易粘连聚团；

2）消化时细胞融合率太高，成片脱落，将不容易被吹散，容易聚团。

解决细胞消化不当，要考虑细胞的生长特性，鉴于该细胞贴壁疏松，普通0.25%胰酶消化时间控制在15s-30s；吹打动作轻柔，控制在10-20次；细胞融合率达到80%传代即可传代。

二、接下来咱们要讨论的是为啥293T换了血清批次后聚团严重？如图3所示，换血清批次后严重聚团的293T细胞，细胞形态难以分辨，黏附在一起。

导致细胞聚团的因素很多，其一是血清批间差导致细胞聚团。血清来源于动物，其组成成分有1000种左右，且血清组成及含量常随供血动物的年龄、生理条件和营养条件而异。每个批号的组分百分比含量都是不固定的，所以批间差异是存在的。293T细胞本身有聚团生长特性，但严重聚团可能受到血清里的某些因子刺激。

图3 换血清批次后严重聚团的293T细胞

如何有效地预防血清批间差呢？可以通过先用血清试用装，试用效果好，可购买和血清试用装批次相同的正装，囤积半年或一年的用量，有效避免批间差对细胞的影响（胎牛血清在-20℃保存可达5年）。

三、接下来我们要讨论的是293T细胞贴壁性问题。通常有两种情况：

第一种情况是为啥用了新批号的血清，细胞贴壁性变差？如图4所示，贴壁疏松的293T细胞。

图4 贴壁疏松的293T细胞

这种情况大概率是血清存在批间差异，而293T细胞本身特点就是贴壁性差，对不同批次的血清适应性不同，就容易出现贴壁疏松现象。可适当加高血清比例（最高不超过20%）；建议试好一个血清批次多屯一些，可以避免血清批间差对细胞的影响。第二种情况是为啥293T细胞从瓶里（例如T25）铺板到孔里（96孔板），贴壁性变差？这种情况排除掉瓶和孔板本身材质或TC（亲水处理）处理因素外，293T细胞贴壁性变差极有可能是因为空间的隔离导致细胞自分泌或旁分泌产生的信号分子浓度太低，不利于细胞的贴壁或增殖。建议在铺板前，对孔板进行明胶包被，可有效促进细胞贴壁。

四、最后咱们要讨论的是转染病毒后细胞凋亡严重，如图5所示，是经病毒转染后漂浮凋亡的293T细胞。

图5 经病毒转染后漂浮凋亡的293T细胞

为啥293T细胞转染病毒后凋亡严重？在排查了方法步骤和转染试剂，依然没有改善的情况下，可排查一下转染前的营养体系，尤其是血清批间差带来的影响。很多同学说前期培养细胞形态正常呀，其实细胞形态学只是鉴别细胞是否健康的一个外在指标，还要结合细胞其它指标对细胞健康进行评定（比如倍增时间，存活率）。通过更换血清批次，再进行转染实验并观察转染后的效果，比较分析出原因。