类器官HE染色、免疫组化、免疫荧光鉴定方法

我们辛辛苦苦养好的类器官，该如何做鉴定呢？通常是HE染色、免疫组化或免疫荧光。今天小爱带大家了解一下具体的染色步骤。

一、HE染色实验步骤

1、类器官收集

1）类器官收集（例如24孔板，收集6-8孔类器官，大约1000-2000个类器官）

移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml左右，移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。300g 4℃离心5min弃去上清。

2）类器官清洗

加入1ml PBS重悬移入1.5ml离心管，300g 4℃离心5min弃去液体。

2、类器官固定

1）PFA固定

加入1ml 4%多聚甲醛至EP管，轻柔吹打混匀，至于4℃固定1h（最长不超过10h）。固定结束后，300g 4℃离心5min弃去上清。

2）类器官清洗

加入1ml PBS重悬移入1.5ml离心管，300g 4℃离心5min弃去液体。

3、类器官琼脂糖包埋

1）称量0.2至0.4g琼脂糖，加入至烧杯或者小试剂瓶内，加入10ml左右PBS。微波炉高火融化，每隔5s暂停打开，观察，重复数次至琼脂糖融化完全。

2）待琼脂糖溶液降温至50-60℃，取20-50ul融化琼脂糖溶液，加入至1.5ml EP管重悬类器官沉淀，冰上放30min，待其凝固。

4、类器官石蜡包埋

1）脱水：取出已凝固的含有类器官沉淀的琼脂糖块，在梯度乙醇中脱水，70%、80%、90%和95%乙醇各1h，100%乙醇30min，待其凝固；

2）融蜡：提前4h左右打开烘箱，65℃溶蜡；

3）透明：将脱水完成后的琼脂糖块转移至组织包埋盒中（二甲苯处理前需一直浸泡在无水乙醇中），将包埋盒转移至二甲苯中5min处理两次；注：因二甲苯有毒性，需在通风良好区域进行操作，取出时尽量沥尽残留二甲苯。

4）浸蜡：透明化处理完成后立即转入已经融化的蜡缸中，60℃浸蜡2h后，更换新的蜡缸再次浸蜡2h；

5）包埋：包埋在冰盒上进行，将融好的纯蜡倒入蜡盒三分之一处，将琼脂块放置于中间位置，然后再滴蜡包埋直到倒满。待蜡块完全凝固后，小心脱下模具。

6）切片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般是5-8um厚，并用小镊子将包含有完整组织的切片置于40°C温水中；7）捞组织：组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2，一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。

5、类器官HE染色

1）脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ 10min；二甲苯Ⅱ10min；无水乙醇Ⅰ5min；无水乙醇Ⅱ5min；95%酒精5min；90%酒精5min；80%酒精5min；70%酒精5min；蒸馏水洗；

2）苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗；

3）伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min，自来水洗；

4）脱水封片：将切片依次放入95%酒精I 5min ；95%酒精II 5min；无水乙醇Ⅰ5min ；无水乙醇Ⅱ5min ；二甲苯Ⅰ5min ；二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

5）显微镜镜检，图像采集分析。

6、类器官鉴定-HE染色结果（以肺癌为例）

人肺癌类器官HE染色

二、免疫组化实验步骤

将HE染色步骤里脱蜡后的切片进行如下处理：

1、抗原修复：加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来；

2、血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）；3、加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜；4、加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37°C温箱中半小时；5、加SABC：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）；6、加显色剂：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀， 再加1滴显色剂C，摇匀，A：DAB， B：H2O2，C：磷酸缓冲液）；7、复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色半分钟；8、脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中；9、封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。

三、免疫荧光实验步骤

将免疫组化步骤里一抗孵育后的切片进行如下处理：

1、加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3min，吸干切片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育1h，PBS浸洗3次；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量避光操作。2、复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，用PBS清洗4次，洗去多余的DAPI；3、封片：防荧光淬灭封片剂封片、荧光显微镜观察。