高效构建CRISPR点突变：模板消除方法解析

CRISPR-Cas9技术是一种强大的基因编辑工具，常用于引入点突变，也就是在基因组特定位置替换单个碱基。此类编辑通常依赖同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）路径，并需要提供一个供体模板（donor template）以指导细胞完成精确修复。

然而，在突变引入后，残留的供体模板或载体可能带来一系列问题，例如随机整合、额外的细胞毒性或代谢负担，甚至可能将筛选标记等非目标序列意外插入基因组。因此，开发有效的模板消除策略对于降低上述风险至关重要。

基于最新研究，本文总结了当前常用的模板或载体清除方法，包括瞬时递送、载体自消除和标记切除策略。这些方法在保持较高的编辑效率的同时，还能有效减少残留模板或载体以及相关标记序列，在细胞系构建、动物模型构建和基因治疗中具有广泛应用价值。

图1. CRISPR-Cas9介导的HDR修复示意图

1. 点突变的基本机制

CRISPR-Cas9 系统通过 sgRNA 引导 Cas9 核酸酶在特定位点切割 DNA，从而产生双链断裂（DSB）。在点突变编辑中，细胞可通过HDR途径，利用供体模板（如单链寡核苷酸 ssODN 或带有同源臂的质粒）修复断裂，从而实现碱基的精准替换。

供体模板的设计至关重要：模板需包含目标突变，并携带适当长度的同源臂。一般而言，ssODN 的同源臂长度约为 30-70 bp，而质粒供体的同源臂通常需要 500 bp 以上，以提高 HDR 效率。

研究显示，编辑位点与sgRNA切割位点距离越近，编辑效率越高。

2. 模板消除方法及其在高效构建突变细胞中的应用

在利用 HDR 引入点突变的过程中，若供体模板未被及时清除，可能带来随机整合、细胞毒性或其他与高残留浓度相关的风险。因此，在获得所需突变后对供体模板进行有效消除，是提高细胞存活率与克隆纯度的关键步骤。

目前的模板清除策略因模板类型（如 ssODN 与质粒 donor）以及宿主系统（如细菌或哺乳动物细胞）的不同而有所差异。合理选择相应方法可实现供体模板的快速移除，从而促进突变细胞系构建过程的高效与可控。

· 瞬时模板递送（Transient Template Delivery）：

o 原理：使用非整合型模板如ssODN，直接注入或电转染细胞。模板不复制，随细胞分裂自然稀释或降解，无需额外消除步骤。

o 应用示例：在兔子PCSK9 S386A点突变模型中，将Cas9 mRNA、sgRNA和ssODN混合微注射到合子中。供体仅在修复窗口期短暂存在，之后自然消失，可直接获得无载体残留的纯合或杂合突变后代。该策略在动物模型构建中具有高效率与低整合风险的优势。

o 优点：简单、无毒性；结合RNP复合物递送，可达20-86% HDR效率

o 局限：适用于小突变；大模板需优化。

· 可控载体消除（Controllable Vector Elimination）：

o 原理：通过设计自消除型载体（如 EXIT 基因线路）实现模板的可控清除。载体由控制模块（含严谨启动子如P_Bad和归巢内切酶如I-SceI编码基因）和消除模块（含抗生素抗性基因和识别序列）组成。编辑完成后，加入诱导剂（如L-阿拉伯糖）激活内切酶，切割载体导致其线性化和降解。

o 应用示例：在基于 pCAS92 和 pGRNA2 构建的 CRISPR 工具中，该系统可应用于大肠杆菌点突变。引入突变后，诱导消除，6-12小时内效率>90%，无载体残留。适用于细菌代谢工程，如构建Atrazine降解突变株，三天内完成无痕编辑。

o 优点：模块化、一步操作；减少代谢负担，支持迭代编辑；相比温度敏感载体，更通用。

o 局限：主要用于细菌；需优化诱导浓度

· 标记切除策略（Marker Excision）：

o 原理：供体质粒除携带目标点突变与同源臂外，还在突变附近插入可筛选标记（如 PGK-Puro^R），并于其两侧设置一对 loxP 位点。Cas9 造成 DSB 后，细胞通过 HDR 将包含突变和标记的片段整合进基因组，因此抗性筛选能显著富集正确编辑的细胞。随后通过 CRE 重组酶切除标记盒，从而实现模板/标记的清除。

o 应用示例：在患者iPS细胞中修复LRRK2 G2019S或AARS1 R329H点突变。通过选择邻近内含子位点切割，可高效整合供体并经 CRE 成功去除标记，且未观察到明显脱靶事件。该"无压力"流程适用于疾病模型研究，可快速获得等基因对照系细胞。

o 优点：通过抗性标记筛选阳性克隆，提高效率；适用于哺乳动物细胞

o 局限：需额外转染步骤；可能引入loxP位点

3. 结语

综上所述，CRISPR-Cas9技术通过HDR途径，为精准引入点突变提供了强大的解决方案。如何高效、安全地消除残留的供体模板，以避免随机整合、细胞毒性等潜在风险，是其中一个关键的挑战。

本文概述的瞬时模板递送、可控载体消除以及标记切除等策略，正是应对这一挑战的有效实践。这些方法不仅显著提升了突变细胞的纯度与存活率，也降低了外源DNA引入的长期负担。

未来，随着载体设计与递送技术的持续优化，点突变模板的消除策略将更加精准、通用。这不仅可加速基础研究中的细胞系与动物模型构建，还将为临床基因治疗提供更安全、高效的技术支撑，推动精准医疗向无痕、可控的方向纵深发展。