秘诀在手│多肽的恒久保存与轻松溶解术

肽 (Peptide) 是α-氨基酸脱水缩合，以肽键 (-CO-NH-) 连接在一起形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。由两个氨基酸脱水缩合形成的化合物叫做二肽，以此类推三肽、四肽、五肽等。有文献把由2~10个氨基酸组成的肽称为寡肽或小分子肽；10~50个氨基酸组成的肽称为多肽。根据组成多肽的氨基酸种类和数量，多肽具有多种生理功能。在医学领域，多肽可用于模拟细胞、诊断疾病和疾病治疗等方面。此外，多肽还具有抗氧化的护肤作用。因此，多肽在生物、医学和化妆品等领域具有重要的应用价值。

一、多肽的保存

多肽的保存分两种情况：一种是冻干多肽的保存，一种是多肽溶液的保存。

冻干多肽的保存：市售多肽大多数是以冻干粉的形式提供，必须冷冻干燥保存。其在-20℃比较稳定，特别是冷冻干燥后保存于-80℃干燥器中，可以维持几年的活性。

在使用前，应先将装有多肽的原瓶置于干燥条件下（如装有干燥剂的干燥箱）恢复至室温，否则多肽可能会因为吸潮导致稳定性降低。瓶盖打开后，应快速称量（微量级多肽可以原瓶溶解，无需称量），并立刻密封避免潮解。

多肽溶液的保存：溶解后的多肽稳定性相对于冻干粉状态会差很多，一般建议溶解的多肽储存液按每次的实验用量分装后-20℃保存。避免反复冻融，因为多次冻融会降低多肽的活性。使用时，取储存液稀释成工作液，现配现用，当天实验未用完的少许多肽溶液建议丢弃。

细菌能够降解多肽，因此多肽需要溶解在无菌的溶剂中（或者用0.2/0.45μm孔径的滤膜过滤除菌）。 此外，需要注意的是含有天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Typ)的多肽易被氧化， 需要保存在无氧化剂的环境中。

二、多肽的溶解

多肽相对一般的生化试剂来说价格比较昂贵，而且溶液状态不稳定，因此科研人员在使用时需要谨慎。多肽的溶解是非常重要的步骤，溶剂选择不当会导致多肽不溶或部分溶解，甚至实验无法进行下去。选择溶解多肽的溶剂时，通常先用无菌水进行溶解度测试（尤其是只有几个氨基酸组成的寡肽）。对于其他特殊多肽，应关注组成多肽的氨基酸性质（表1），然后确定要溶解的多肽是酸性、中性还是碱性多肽。

表1 常见氨基酸的酸碱性

多肽酸碱性判断技巧

将多肽序列中的每个酸性氨基酸和C端的羧基-COOH赋值为+1、每个碱性氨基酸和N端的氨基-NH2赋值为-1、中性氨基酸赋值为0，以此为基础计算整条多肽的值，最终得分为正的称为酸性多肽，得分为负的称为碱性多肽，得分为零的称为中性多肽。

酸性多肽的溶解：先尝试用水溶解，如果用水不能溶解，尝试使用13%的氨水(v/v)来溶解，并将多肽溶液稀释至需要的浓度。如果多肽序列中包含半胱氨酸(Cys)，不能使用碱性溶液进行溶解（在碱性溶液中，半胱氨酸分子会接受质子，形成带正电荷的离子，溶解度会降低。）可以使用二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)进行溶解。

中性多肽的溶解：通常先用最少量的强有机溶剂溶解。先尝试使用甲醇、异丙醇或乙腈进行溶解。对于疏水性很强的多肽，先用少量的DMSO（序列中无Cys、Met、Trp ）溶解，再稀释到需要的浓度。将溶解肽的有机溶剂缓慢地逐滴加入水溶液中，如果溶液变浑浊，可能是达到了溶解极限，不能再继续溶解。

碱性多肽的溶解：先尝试用水溶解，如果不能溶解，尝试使用10%-30%的醋酸来溶解。如果多肽还是不溶，建议尝试三氟乙酸TFA(<50μL)或纯醋酸来溶解，最后将多肽溶液稀释到需要的浓度。

易聚集肽的溶解：对于Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、His、Lys、Ser、Thr、Tyr含量高(>75%)的多肽易聚集（水溶液中易形成多余的分子间氢键），可以用6M的盐酸胍 (Guanidine hydrochloride) 或8M的尿素 (Urea) 溶解制备储存液，最后稀释到需要的浓度。

三、多肽应用

案例：NOX2抑制剂gp91 ds-tat 用于进一步验证人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 在高糖环境中ROS产生的来源。

简介：gp91 ds-tat是一种有生物活性的肽（NADPH氧化酶组装肽抑制剂），科学研究中常用作NOX2信号通路抑制剂。 分子式：C109H202N52O25S1；分子量：2673.19；纯度：95%。

序列：H-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Ser-Thr-Arg-Ile-Arg-Arg-Gln-Leu-NH2

实验方法：

1、人脐静脉内皮细胞接种于6孔板上（5 ×10^4个/孔）。

2、用PBS、芦丁、GKT137831（NOX4抑制剂）和Nox2ds-Tat（即gp91 ds-tat）预处理0.5h，然后用高糖处理48h。

3、收集细胞，用10mM DCFH-DA在37℃黑暗条件下孵育30min后用冷PBS洗涤细胞两次。

4、用流式细胞仪 (Becton，Dickinson and Company，New Jersey，USA) 在激发波长为488nm，发射波长为525nm的条件下分析细胞。用Cell Quest软件 (Moleular Devices Corporation) 计算ROS的相对荧光强度。

实验结果图：

* 数据来源：Wang W, Wu QH, Sui Y, et al. Rutin protects endothelial dysfunction by disturbing Nox4 and ROS-sensitive NLRP3 inflammasome[J]. Biomedecine & Pharmacotherapie, 2017.

本期小爱为大家介绍了多肽的保存、溶解和文献应用。多肽是一类非常不稳定的化合物，所以我们在使用时最好现配现用。如果您的多肽没有溶解方法可供参考，建议先用少量肽来测试最适溶解方法，只有当多肽完全溶解后，才能加入溶液并将之稀释至最终浓度。

附表：氨基酸简写符号

免责声明：有些多肽在使用前需要做溶解度测试，本文仅供您参考，希望对您溶解多肽有所帮助。