工具篇 | mRNA标准品应用案例展示

背景介绍：

新冠病毒mRNA疫苗的成功开发使得mRNA技术得到空前的关注。mRNA技术作为一种通用性技术，其研发路径和生产工艺显著区别于传统的生物医药研发模式，有望在传染病疫苗、肿瘤疫苗、免疫治疗、蛋白替代疗法、治疗性抗体等多个领域得到广泛应用，引领医药研发进入新纪元。

在对于核酸药物递送系统研究、蛋白表达的疗效研究以及mRNA药物研发中工具mRNA起到非常重要作用，那么大家知道什么是工具mRNA，它的作用是什么呢？

什么是工具mRNA？

工具mRNA（mRNA标准品）即成品的标准型信使核糖核酸（类似于大家分子实验中常用的成品质粒）。后续无需对mRNA标准品进行任何处理，可直接应用于相应实验。

其中线性mRNA采用化化学合成的Cap1帽结构，使线性mRNA具有高比例的天然帽子结构，修饰碱基 (N1-Methylpseudo-UTP、Pseudo-UTP、5-Methoxy-UTP、5-Methyl-CTP、N6-Methyl-ATP) 有5种可供选择，同时使用优化了适用于哺乳动物细胞的密码子、UTR、polyA结构。环状mRNA通过体外转录生成并环化，继而分离纯化得到成品。

工具mRNA分类：

1、报告基因类

报告基因类mRNA常用于细胞转染、翻译效率、药物递送、体内成像等研究。其中EGFP mRNA是一种最常用的示踪蛋白mRNA，荧光稳定性强，用于表达加强的绿色荧光蛋白（分离自水母），发射波长为509nm，可通过荧光显微镜或者流式细胞术检测，是观察mRNA递送、翻译的理想工具。

图 EGFP mRNA Agarose电泳条带

图 HEK293细胞转染EGFP mRNA 24h后表达效果

还有其他报告基因类工具mRNA如tdTomato mRNA、YFP mRNA、mBanana mRNA等荧光蛋白mRNA，可用于对照验证实验。

2、基因编辑类

CRISPR/Cas9是先进的基因编辑系统，被广泛用于治疗各类疾病。Cas9 mRNA可在细胞内瞬时表达Cas9蛋白，能减少免疫反应和脱靶风险。

3、免疫抗原类

免疫抗原类mRNA是肿瘤免疫疗法的理想研究工具。卵白蛋白 (OVA) 是丝状蛋白超家族的一员，是在蛋清中发现的主要糖蛋白。是一种常用的免疫和生化研究抗原，是一种已建立的气道高反应性模型过敏原，可激活细胞免疫和体液免疫。

4、蛋白替代类

EPO mRNA用于表达人源EPO蛋白 (human erythropoietin) 。我们使用 (Abs CapTM) 在体外转录生产了EPO mRNA，化学合成的Cap1结构使其具有高比例的天然的mRNA帽子结构，从而获得高效的表达效果。

工具mRNA产品特征：

工具mRNA产品优势：

1、Cap1型帽结构，提高mRNA稳定性及翻译效率，更适合哺乳动物；2、5种修饰可供选择，加入修饰碱基可提高翻译效率，降低免疫原性；3、合适的PolyA尾结构，保证mRNA稳定性和翻译效率；4、完整性高，质控严格，方便研究和应用。

实验案例1：

用核酸转染试剂盒转染mCherry mRNA至HEK293细胞24h、48h，在荧光显微镜下观察到的红色荧光稳定且信号强。

图 转染mCherry mRNA 24h后的荧光

图 转染mCherry mRNA 48h后的荧光

实验案例2

用mRNA转染试剂在不同类型细胞中转染线性工具mRNA-EGFP mRNA，处理细胞24h后利用荧光显微镜拍照，各种细胞都呈现较强的绿色荧光。

图 转染EGFP mRNA于不同类型细胞中

实验案例3

注射线性Luciferase mRNA至活体小鼠体内，小鼠体重150ug，每针注射20uL，共计3针，3天后进行活体成像。

图 Luciferase mRNA注射小鼠后活体成像

FAQ：

1、工具mRNA保存条件是什么？

A：需要低于-40°C保存，-80℃冰箱或液氮保存都可以。若不小心将mRNA短期（例如1天）存放于-20℃，可以在正式实验之前将mRNA跑琼脂糖凝胶电泳看其是否降解。

2、工具mRNA是什么状态？

A：主要是液体状态，通用溶剂一般是1mM柠檬酸钠盐溶液，pH为6.4。

3、工具mRNA的纯度能达到多少？

A：线性mRNA可达到90%的纯度；环状mRNA如果长度是3-5k，可达到科研级别纯度，通常能达到85%的纯度。环状mRNA序列越长，关环效率越低，纯化难度越高。

4、工具mRNA推荐的帽结构是哪一种？

A：Cap1 AG。加帽率高达95%。