新抗原的鉴定、预测、验证与TCR鉴定

一、新抗原的鉴定、预测与验证

新抗原预测的标准流程包括多个连续步骤。首先识别突变，随后进行HLA分型，接着实施筛选过程，然后根据新抗原与HLA的结合亲和力及免疫原性对其进行优先排序，最后通过T细胞反应分析对具有免疫原性的新抗原进行实验验证（图1）。

图1 新抗原鉴定与验证的典型工作流程。新抗原的鉴定与验证通常通过以下两种方法进行。第一种方法是从患者来源的肿瘤组织中分离DNA和RNA，利用多组学数据识别突变，随后采用计算方法或AI工具预测新抗原。之后合成候选肽段，并检测其与MHC分子的结合亲和力，以确认其作为新抗原的潜力。第二种方法基于从患者肿瘤组织和正常组织中鉴定存在的肽段，该方法利用HLA抗体沉淀肽-MHC复合物，再通过洗脱释放肽段，随后应用肽段质谱技术确定所释放肽段的序列。在肽段的实验验证中，一种有效的方法是将T细胞与合成肽段及抗原呈递细胞共培养，通过IFN-γ ELISPOT实验评估T细胞活化程度，并通过流式细胞术检测T细胞表面CD137的表达水平。

1.1 突变类型鉴定

寻找新抗原的第一步是确定发生的突变类型，然后根据这些突变寻找潜在的有效肽类新抗原。目前的技术已进一步发展，能够整合多种组学数据，例如WES、高通量测序技术、RNA-seq以及蛋白质组学数据，通过比较同一患者肿瘤组织与正常组织的遗传数据，来识别所发生的突变类型。

WES被认为是新抗原预测中NGS数据的推荐选择，因其专注于基因组的蛋白质编码区域，能够实现最高水平的突变覆盖。此外，将RNA-seq数据与WES数据结合，可以确定肿瘤中突变基因的表达状态。

1.2 HLA分型

HLA分子是一组位于人类细胞表面的重要分子。HLA分子可分为三类：I类、II类和III类。I类包括HLA-A、HLA-B和HLA-C，表达于几乎所有有核细胞的表面，负责将内源性抗原（如病毒或肿瘤抗原）呈递给CD8+ T细胞，从而激活CTLs的免疫反应。II类HLA分子包括HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，主要表达于专业抗原呈递细胞（如B细胞、巨噬细胞和DCs）表面。HLA II类分子的主要功能是将外源性抗原（如细菌或寄生虫抗原）呈递给CD4+ T细胞，并激活Th细胞的免疫反应。III类HLA分子包含一些补体成分（如C2、C4）和细胞因子（如TNF-α），在炎症反应及其他免疫调节过程中发挥作用。人类拥有超过24,000种不同的HLA-I和HLA-II等位基因，导致HLA分子具有高度多样性，不同HLA分子识别的肽段也各不相同。HLA类型决定了T细胞能够识别的肿瘤特异性肽段类型，因此明确HLA类型十分必要。通常通过分析NGS数据，并使用OptiType和Polysolve来鉴定HLA-I类型。

1.3 新抗原表达、与HLA结合及免疫原性的预测

新抗原引发免疫反应的过程主要包括以下步骤：异常突变基因的转录、翻译、加工和降解。随后，这些新抗原则由MHC分子呈递，并被T细胞识别和靶向。因此，为了预测和鉴定新抗原，也应整合这些关键步骤的结果。值得一提的是，随着AI的发展，基于深度学习的工具已成为预测新抗原的常用且不可或缺的方法。这些方法不仅能从肽段呈递的单一环节进行考量，还可整合所有步骤以提供全面的结果，在新抗原预测方面展现出强大的能力。

转录表达

突变基因的转录水平直接影响其所编码肽段的丰度，进而决定细胞表面呈递的p-MHC复合物的数量。一些研究发现，新抗原表达下调是免疫逃逸的一种机制。即使肽段与MHC分子之间的亲和力较低，足够的肽段表达仍可弥补这一不足，并生成足够数量的p-MHC复合物。因此，许多研究根据新抗原的表达水平对其进行排序。这种方法也为纳入转录水平较低的抗原以扩展潜在靶点提供了可能性。

MHC结合与亲和力

肽与MHC分子的结合是抗原呈递的关键步骤。因此，基于机器学习和AI的大量研究被开发用于预测结合亲和力，其中主要聚焦于MHC I类分子。重要的工具包括NetMHCpan、NetCTL和NetCTLpan。这些工具基于实验数据（如结合亲和力实验和洗脱配体的质谱分析）进行训练，通过计算算法显著提升了预测性能。最近一项基准研究表明，使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析不同工具的预测能力时发现，NetMHCpan和MHCflurry在ROC曲线下面积方面表现最佳。由于MHC II类分子与肽的相互作用较为宽松，表现为更广泛的肽长度和更灵活的结合模式，因此针对MHC II类的预测工具相比MHC I类精确度较低。一系列利用人工神经网络开发的计算方法已被提出用于预测与主要MHC II类分子结合的表位，其中包括NetMHCII、ProPred、MHC-Pred和SYFPEITHI。MHC II类的预测在肽长度、结合序列模式以及α链和β链的多态性方面更为复杂。

除了结合亲和力之外，一些工具如NetChop和NetCTL还能预测蛋白酶体切割以及TAP复合物将肽段转运至内质网的过程，这些是抗原在与MHC分子结合前加工过程中的关键初始步骤。然而，由于MHC呈递预测方法的开发基于已经历了这些早期加工步骤的MHC洗脱配体数据，因此将切割、转运和结合的预测整合在一起的实际效用仍存在争议。

免疫原性预测

即使一个肽段具有较高的表达水平和与MHC的强结合亲和力，pMHC复合物仍可能无法被T细胞识别或引发T细胞反应。因此，准确预测免疫原性至关重要。近年来出现了一些用于预测免疫原性的工具，例如BigMHC，该工具通过将BigMHC EL（呈递）域的知识迁移至BigMHC IM（免疫原性）域来实现预测。BigMHC IM使用PPVn进行评估，即在前n个预测的pMHC中具有免疫原性的比例。其平均PPVn达到0.4375，显著优于此前最优的方法HLA，ranks。这一结果凸显了迁移学习在此场景中的有效性。

由AI驱动的新抗原预测

AI工具还可整合肽呈递的全部步骤进行综合考量，从而提供更全面的整体预测。pVAtools结合了突变频率、基因表达水平和MHC亲和力信息，对来自黑色素瘤、肝细胞癌和肺鳞状细胞癌各100例的TCGA数据集预测新抗原，获得了多出42%的新抗原候选物。经过筛选和过滤后，pVAtools平均为每位患者获得16个新抗原，并保留了实验验证呈阳性的肽段。此外，也有研究构建了一条整合DNA测序、RNA测序和质谱技术的流程，便于研究人员使用。例如，NeoDisc整合了公开可用和内部开发的软件，用于免疫肽组学、基因组学和转录组学，以识别和预测新抗原。研究人员以宫颈腺癌为例展示了NeoDisc的优先排序能力，结果显示在宫颈腺癌（CESC）肿瘤质谱免疫肽组数据中，前10名包含6个免疫原性肽段，并确认了两个免疫原性新抗原。

此外，算法还纳入了其他潜在相关的生物学特征，例如差异性agretopicity指数以及突变型与野生型抗原之间的相似性，以对新抗原候选物进行排序。这些算法整合了可能影响新提出的表位候选物激活T细胞效果的特征。这与通过序列同源性来分析自身抗原的方式形成对比。此外，这些特征还可能影响因出现抗原缺陷型变异而导致免疫逃逸的概率。例如，通过DNA测序数据分析确定的突变克隆性以及通过数据库搜索识别出的驱动突变均被纳入考虑。

1.4 基于免疫肽组学的突变肽验证

除了预测结合亲和力和免疫原性的计算工具外，质谱（MS）仍然是识别与细胞MHC结合的突变肽并发现真实新表位的最直接方法，因为它能够检测体内存在的p-MHC复合物。近年来质谱技术的进步提高了灵敏度，使得从更少的细胞中也能检测到新抗原。研究人员利用先进的质谱分析对黑色素瘤相关免疫肽组进行了调查，鉴定出存在于肿瘤组织中的体细胞突变相关肽配体，其中11个配体中有4个可诱导T细胞反应。此外，MS已与NGS结合，以增强对源自体细胞突变、非编码RNA和蛋白酶体剪接的肿瘤特异性新抗原的检测。这种组合弥补了传统全外显子组或RNA测序方法的局限性，这些方法可能会遗漏某些新抗原。

1.5 候选新抗原免疫原性的验证

使用计算工具筛选出的新生抗原必须通过实验方法进行验证，这些方法大致可分为体内和体外两种途径。体内验证通常涉及将患者来源的肿瘤异种移植到人源化小鼠体内。这种方法确保了直接来源于人类样本而非体外培养的肿瘤保留了原始肿瘤的特征和表型特性。

对于体外方法，测量T细胞反应是评估候选新抗原免疫原性的直接途径。在新抗原肽刺激T细胞后，可通过流式细胞术定量反应活性，重点关注表达在细胞表面的T细胞活化蛋白标志物，如4-1BB（CD137）和OX-40（CD134）。此外，还可采用ELISPOT实验检测T细胞受刺激后分泌的IFN-𝛾。该高灵敏度方法通过特异性抗体捕获细胞因子形成斑点，从而评估单个细胞的细胞因子分泌情况，同时反映新抗原的细胞因子含量及其免疫原性。

T细胞的刺激可通过APC依赖性机制实现，该方法在新抗原验证研究中被广泛使用。标准方法是将候选多肽脉冲处理APC（如DCs或B细胞），随后与T细胞共培养。来自患者或荷瘤小鼠的TILs在这些检测中尤为有价值，因为其TCRs已历经体内筛选，能够有效识别p-MHC复合物。抗原特异性T细胞的反应性通常通过IFN-γ ELISPOT和流式细胞术进行评估，以量化激活标志物（如CD69、CD137）和细胞因子的产生。

二、TCR鉴定：从已知表位到特异性TCR序列

特定的新抗原可以触发相应TCR及T细胞应答的产生。识别能够识别抗原的特异性TCR序列至关重要。然而，由于TCR和抗原库的高度多样性以及TCR与pMHC之间相互作用的复杂性，鉴定表位特异性T细胞受体极为困难。目前用于TCR鉴定的一些常见技术方法及其相关挑战如下：

2.1 TCR测序

TCR包含两种主要类型的受体：αβ链受体和γδ链受体。大约95%的人类T淋巴细胞携带αβ链受体，该受体识别由MHC分子呈递的肽段。其余5%的T细胞携带γδ链受体，这类受体不受MHC分子限制，能够识别更广泛的分子，包括脂类以及可能的其他非肽类抗原。由于αβ链受体在识别MHC呈递的肽段方面占主导地位且作用关键，研究通常集中于对αβ链受体T细胞进行测序。

TCR测序的基本思路是通过对T细胞转录产物进行逆转录获得cDNA，再通过PCR扩增αβ链受体区域，随后对TCR片段进行测序（图2）。然而，在T细胞发育过程中发生的VDJ重排导致TCR的5'基因区域具有高度变异性，从而增加了相应片段扩增的难度。为应对这些挑战，已发展出新的PCR技术，其中应用最广泛的两种方法是5'端cDNA末端快速扩增技术（5'RACE）和多重PCR。5'RACE是指在5'端序列未知的情况下，根据序列特异性设计引物，最终获得完整的cDNA序列。多重PCR则使用多对引物，每对引物结合不同的模板区域，以提高扩增的特异性。TCR测序面临的一个重要挑战来自T细胞表达产物的切割，这会导致α链和β链分离，从而使不同细胞的TCR链混合在一起，难以准确配对两条链。为解决这一问题，研究人员已开发出多种策略。

（1）单细胞RT-PCR：通过荧光激活细胞分选（FACS）将单个T细胞分选至含有RT-PCR反应缓冲液的孔中，然后通过RT-PCR扩增每个细胞的TCRα和β链。该方法无需在分离特异性T细胞后进行T细胞克隆扩增，从而减少了培养单个T细胞克隆所需的时间和工作量。然而，该方法目前尚无法对所分析细胞的抗原特异性进行分析评估。

（2）单细胞RNA测序：这是一种分析TCR并获取T细胞抗原特异性信息的新型有效平台。近期研究已成功应用该技术，通过对肽段刺激的T细胞进行RNA测序实验，实现对特定抗原T细胞的识别。该方法使研究人员能够根据效应细胞因子（如IFN-𝛾和TNF-𝛼）表达水平的升高来定位抗原特异性T细胞。随后可从这些活化的细胞中获取TCR α和β链的转录本。尽管该方法具有高度特异性和快速性，但涉及复杂的技术操作。

图2 TCR测序示意图。该过程首先从生物样本中提取DNA或RNA。使用多重PCR扩增TCR的CDR3区域，该方法适用于DNA和RNA。该区域高度可变，对TCR功能至关重要，因为它直接与pMHC相互作用。对于RNA样本，特别适合采用RACE结合巢式PCR来获得TCR的全长序列。也可通过单细胞RNA测序从RNA样本中获取TCR序列。

2.2 选择特定T细胞的策略

在富集多克隆T细胞产物以获得所需特异性后，从大量T细胞群体中分离抗原特异性T细胞便成为关键步骤。一种广泛采用的方法基于T细胞功能分析。

在此策略中，首先使用特定肽段刺激T细胞以触发免疫反应。随后，根据与T细胞活化相关的分子表达升高来分离抗原响应性T细胞。例如，CD8+ T细胞活化后会上调4-1BB，而CD4+ T细胞则会上调OX40。该过程涉及对T细胞刺激后短暂上调的跨膜蛋白进行抗体染色。因此，这些细胞可通过FACS或磁珠分离技术进行分离。然而，该方法依赖于T细胞的正常功能，可能不适用于功能受损的TILs。

另一种分离技术则聚焦于活化T细胞产生的IFN-γ。在此方法中，T细胞分泌的IFN-γ通过细胞因子特异性的捕获试剂在细胞表面被捕获，从而可通过磁性分离或流式细胞术选择性地识别和分离正在分泌的T细胞。该方法能够根据效应T细胞对抗原暴露的功能反应，有效识别和分离这些细胞。

2.3 观测平台

以往选择特定T细胞并分析其功能的方法主要依赖于评估整个细胞群体的活性以及单一激活标志物。为了更深入地理解T细胞，迫切需要开展更多针对单个细胞的细致分析。开发了一种名为lightning的光流体系统，能够在短时间内精确可视化表型并对单个细胞进行功能分析。该系统利用小型硅芯片结合微流控技术分离和培养细胞，可在数日内同时实现上千个单细胞的快速克隆、生长、分析与回收，相较传统方法耗时数月而言是一项显著提升。该平台可将T细胞与其他类型细胞共同加载，从而评估细胞间相互作用、细胞表面表型、细胞毒性和细胞因子分泌情况，全面揭示单个细胞的功能特性。借助该系统，研究人员能够直观记录实验过程，观察表型响应，在不破坏细胞的前提下完成功能分析，识别表现出反应性行为的目标细胞，并进一步将这些信息与下游测序数据整合，以鉴定出特定的TCR序列。目前已有大量研究应用了这一平台，充分证明了其有效性。

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Foy SP, et al. Non-viral precision T cell receptor replace-ment for personalized cell therapy. Nature. 2023;615:687-696.

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