一文说透Native-PAGE

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性，保证了蛋白质功能。

为什么SDS-PAGE需要对蛋白进行变性处理？

在天然状态下，蛋白以折叠的形式存在，且在同一分子内同时具有正电荷和负电荷，电荷和折叠方式的不同，使具有相同分子量的不同蛋白质在凝胶上以不同的速度迁移，这让聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的分离变得困难，变形处理可以保证蛋白质的迁移率仅取决于蛋白质的分子质量的大小。

SDS和DTT作为WB常用的试剂，有何作用？

SDS：是一种去污剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构，使折叠的蛋白质变性成线性分子。此外，SDS以使负电荷均匀地附着蛋白质。

蛋白质和SDS之间的相互作用

DTT：二硫苏糖醇，使半胱氨酸残基间的二硫键断裂，阻止蛋白质中的半胱氨酸之间形成二硫键。但无法还原包埋于蛋白质结构内部的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先通过加热或者变性剂等使蛋白质结构打开。

是否添加DTT对电泳的影响

Native-PAGE实验方法

电泳在操作上基本和SDS-PAGE上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白，酸性蛋白通常采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置。

1、样品准备

细胞超声即可，超声后离心取上清，将样品与样品缓冲液混合，注意不要加热样品，以避免蛋白质变性。上样缓冲液中不能含有SDS等变性剂。

2、电泳

在非变性条件下，蛋白的迁移与蛋白的电荷、蛋白形状以及蛋白分子量都有关。蛋白分子量的确定应该是在不同凝胶浓度下，确定出蛋白的Rf值，绘制出凝胶浓度对Rf的曲线从而判定蛋白的分子量。

电泳的过程中，电压过高可能引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块降低温度；如果蛋白质的分子量较大，电泳时间可以延长，使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开。

3、染色与分析

电泳完成后，将凝胶剥下，采用考马斯亮蓝染色或银染的方法观察蛋白质条带。

银染操作步骤（需自备乙醇、乙酸和去离子水)

1）取适量样本，开展SDS-PAGE凝胶电泳；

2）固定：将电泳后的凝胶从玻璃板上剥离下来，清水冲洗⼲净，放⼊⼲净的直径12cm玻璃皿中，加⼊去离⼦水没过胶，盖上盖⼦，在脱色摇床上室温摇晃5min，弃掉去离⼦水，加⼊固定液没过胶，盖上盖⼦，在脱色摇床上室温摇晃30min。

固定液配制：依次加⼊17.5mL⼄醇、3.5mL⼄酸和14mL去离⼦水，混匀后即成35mL固定液。

3）致敏：弃掉固定液，加⼊去离⼦水没过胶，盖上盖⼦，在脱色摇床上室温摇晃5min，重复水洗⼀次，共2次，加⼊致敏液没过胶，盖上盖⼦，在脱色摇床上室温摇晃30min。

致敏液配制：31.5mL去离⼦水中加⼊3.5mL致敏液I 、70μL致敏液II 、100μL致敏液III，混匀后使⽤，现⽤现配。

4）染色：弃掉致敏液，加⼊去离⼦水没过胶，盖上盖⼦，在脱色摇床上室温摇晃2min，重复水洗⼀次，共2次，加⼊染色液没过胶，盖上盖⼦，在脱色摇床上室温摇晃20min。

染色液：35mL纯水⼊加0.35mL银溶液，30μL显色液Ⅱ混匀，现⽤现配。

5）显色：弃掉染色液，加⼊去离⼦水没过胶，盖上盖⼦，在脱色摇床上室温摇晃1min，重复水洗⼀次，共2次，加⼊显色液没过胶，在脱色摇床上室温摇晃2min左右，溶液变浑浊，弃掉液体，加⼊新的显色液继续显色至⽬的条带清晰，拍照。

显色液：31.5mL去离⼦水中加⼊3.5mL显色液I，15μL显色液Ⅱ混匀，现⽤现配。

4、蛋白回收

根据染色结果切取含有蛋白质的胶带，用手术刀切碎，装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液（能维持蛋白活性的，通常与Native PAGE电泳液相同），最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3h，电泳完毕取出透析袋，在重蒸水或者合适的缓冲液中透析，透析完毕后浓缩。

以上为基础指南，具体操作需要根据实验条件和目标蛋白质的特性进行调整。