脂质染色 | 脂滴&胆固醇染色技术全攻略

脂质是一类广泛存在于生物体中的有机分子，它们在细胞的结构和功能中扮演着重要角色。脂滴和胆固醇是脂质的不同形式，它们在结构和功能上有所不同。脂滴是中性脂的主要贮存场所，包括脂酰甘油和酯化胆固醇。在病理情况下，如器官发生脂肪变性，细胞内可能出现脂滴增多，通过脂肪染色能将这些脂滴清晰的显现出来。胆固醇是真核细胞细胞膜的重要成分，能够维持膜结构完整性，调节膜流动性，参与信号转导，在动脉硬化、Ｃ型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)、阿尔茨海默病等疾病的发生发展过程中起着重要作用。

脂滴和胆固醇的染色是病理学和细胞生物学研究中的重要技术，用于观察和量化细胞内脂质的积累。目前，脂滴染色使用最广泛的染料包括油红O(Oil Red O)、尼罗红(Nile Red)、苏丹染料(Sudan Dyes)等。胆固醇染色使用最多的染料是菲律平(Filipin III)，Filipin已被广泛应用30余年。它可用于标记生物膜结构上及非细胞结构内的自由胆固醇，也能配合应用胆固醇酯化酶，使胆固醇酯水解成自由胆固醇而间接显色。

接下来，小爱就给大家详细介绍脂滴和胆固醇的染色方法。

一、脂滴染色

1、组织切片脂滴油红O染色

1）实验原理

油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状。脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片置入染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质（如脂滴）中，使组织内的脂滴呈橘红色。

2）染色步骤[1]

① 油红O染色液配制：

a.母液准备：称取1g油红O，加入100mL异内醇配置成储存液，棕色瓶4℃密封保存。

b.工作液准备：使用前加双蒸水稀释至60%，滤纸过滤后使用。

② 用冰冻切片机切取5μm厚的肝组织切片；

③ 用95%乙醇固定，蒸馏水清洗1min，60%异丙醇浸泡30min；

④ 再用60%油红O染色溶液处理10min和15min，蒸馏水冲洗1min；

⑤ 苏木素复染，用自来水清洗1~3min，光镜下观察肝细胞脂质沉积情况。

3）肝组织油红O染色结果图：

（注：图片来源于文献[1]）

2、细胞脂滴尼罗红染色（以下染色方法仅供参考）

1）实验原理

尼罗红是一种亲脂性荧光染色剂，它是一类环境敏感性荧光染料，能够在富含脂质的环境中产生强烈的荧光，而在水性介质中的荧光强度极小，这种特性使得它成为了一款极重要检测细胞内脂滴的荧光指示剂，可以通过荧光显微镜和流式细胞检测结果。

2）染色步骤

① 尼罗红染色液配制：

a.母液准备：取适量的尼罗红（Mw：318.37g/mol）用无水DMSO充分溶解制备1mM储存液，按照单次用量分装冻存，避免反复冻融，避光保存。

b.工作液准备：用HHBS或生理缓冲液(pH 7.0)将母液按1:1000稀释为1×尼罗红工作液，漩涡混匀。

【注意】：

尼罗红的实际染色浓度请参考文献或实验室体系来调整。以上只做参考。

② 用检测化合物处理细胞一段时间；

③ 离心并调整细胞浓度为1-5×10^5cell/管；

④ 用500µL尼罗红工作液重悬细胞；

⑤ 室温或37ºC避光孵育5-10min；

⑥ 吸掉染色工作液，用HHBS或适当缓冲液清洗细胞；

⑦ 用500µL预热的HHBS或培养基重悬细胞，使细胞密度为1-5×10^5cell/管；

⑧ 荧光显微镜或流式细胞仪检测荧光信号，Ex/Em=552/636nm。

【注意】：

① 对于贴壁细胞，可用HHBS或适当缓冲液清洗细胞，然后直接加入尼罗红工作液孵育；

② 细胞也可预固定，然后用尼罗红工作液染色。

二、胆固醇染色

细胞胆固醇菲律平(Filipin III)染色

1）实验原理

菲律平的主要成分是Filipin III，它可以特异性地与游离胆固醇相互作用，而不与酯化的胆固醇结合。这种特异性结合是由于菲律平分子结构中包含多个共轭双键，使其能够与胆固醇分子的疏水部分形成复合物。当Filipin III与游离胆固醇结合后，其激发光谱波峰约在360nm处，发射光谱波峰约在480nm处。通过检测这些特定波长附近的荧光信号，可以表征细胞内的胆固醇含量。

2）染色步骤[2]

① 菲律平染色液配制：

a.母液准备：1mg菲律平粉末中加入1mL DMSO，完全溶解配置成1mg/mL储存液，按照单次用量分装冻存，避免反复冻融，避光保存。

b.工作液准备：使用前，取适量母液加入到PBS中，稀释成一定浓度的工作液（如0.1mg/mL）备用。

② 将细胞接种于盖玻片中，培养12-18h；

③ 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，在室温下用4%多聚甲醛固定20min；

④ 室温下用0.1mg/mL菲律平III处理细胞30min；

⑤ 细胞再用0.35μg/mL碘化丙啶(PI)染色5min；

⑥ 最后，用共聚焦激光扫描显微镜在405nm处检测菲律平和PI染色的荧光强度。

3）星形胶质细胞/神经元细胞菲律平染色结果图

（注：图片来源于文献[2]）

参考文献

[1] Ji X, Ma Q, Wang X, et al. Digeda-4 decoction and its disassembled prescriptions improve dyslipidemia and apoptosis by regulating AMPK/SIRT1 pathway on tyloxapol-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice[J]. J Ethnopharmacol. 2023;317:116827.

[2] Huang Y, Zhang W, Guo X, et al. Cellular cholesterol loss by DHCR24 knockdown leads to Aβ production by changing APP intracellular localization[J]. J Lipid Res. 2023;64(5):100367.