mRNA的定制APC可引发强烈的T细胞反应，诱导特异性CTL

基于mRNA的治疗手段在SARS-CoV-2疫苗中已展现出显著成效，并正在癌症免疫治疗领域崭露头角。然而，传统mRNA癌症疫苗受限于肿瘤相关抗原及新抗原的低免疫原性。这里，通过开发一种模块化的脂质体包裹mRNA混合物来克服这一局限，该混合物包含3种不同的mRNA，分别编码肿瘤抗原、共刺激分子CD80以及膜锚定型IL-2。给予该mRNA混合物后，可在体内将体细胞转化为"设计型APCs"，同时表达抗原、共刺激分子和细胞因子。相较于仅编码抗原的mRNA，这些设计型APCs能更有效地激活肿瘤抗原特异性的CD8⁺ T细胞，并引发强烈的抗肿瘤免疫应答。此外，在mRNA混合物中将IL-2替换为膜锚定型IL-12后，可促进内源性抗原特异性Th1辅助T细胞在体内的扩增与分化。尤为重要的是，该平台不仅在体外的人PBMCs中，也在HLA-A*02:01转基因小鼠体内成功激活了NY-ESO-1特异性的CD8⁺ T细胞，凸显其临床转化潜力。这种模块化mRNA策略可原位重编程体细胞成为设计型APCs，为精准免疫治疗提供了一个灵活且具备转化前景的平台。

mRNA疫苗展现出良好的实用性和安全性，全球对mRNA疗法的关注持续上升。因此，针对多种传染病以及癌症的疫苗研发正在积极推进中。在癌症免疫治疗中，编码癌症新抗原的mRNA目前正在临床试验中推进。近期的研究重点是编码存在于癌细胞中的多种新抗原序列的疫苗。然而，在癌症疫苗的背景下，mRNA单独使用的效果仍然有限，通常需要同时联合使用免疫检查点抑制剂和其他抗癌疗法。这凸显了开发更有效方法来激活CD8+ T细胞以增强抗肿瘤反应的必要性。

将mRNA递送至细胞内会引发一系列事件，首先其被翻译成蛋白质，随后这些蛋白质被蛋白酶体降解。所产生的肽段与MHC I分子结合，并呈现在细胞表面，供CD8+ T细胞识别。然而，T细胞的活化不仅依赖于TCR的结合，还需要共刺激信号。虽然专业的APCs表达这些共刺激分子，但非APCs缺乏此类分子，因此在摄取mRNA后无法直接激活初始CD8+ T细胞。在这种情况下，专业APCs的交叉呈递就变得至关重要。非抗原呈递细胞（non-APCs）摄取编码抗原的mRNA后，依赖于将抗原传递给DC细胞，尤其是XCR1⁺ 1型cDC1s，这类细胞擅长交叉呈递抗原并进一步激活CD8⁺ T细胞。这种依赖性意味着mRNA疫苗的治疗潜力可能受限于抗原传递效率以及具有交叉呈递功能的DC细胞亚群的功能状态。为克服这一限制，近期研究集中于开发优先靶向DC细胞的LNPs，包括cDC1s和迁移型cDC2s。通过设计可离子化脂质，或将mRNA与靶向DC细胞的递送平台（如脂质纳米颗粒LNPs或脂质复合物LPX）进行配制，现已可实现mRNA在DC细胞中的选择性递送。这种靶向策略避免了抗原从非APCs转移的需求，使抗原及共刺激分子能够在DC细胞内直接表达。这些递送系统在临床前肿瘤模型中已显示出更强的CD8⁺ T细胞启动能力及更优的治疗效果，进一步支持将mRNA定向递送至抗原呈递细胞作为下一代癌症疫苗的关键策略。

这里，提出一种新方法，通过引入编码肿瘤抗原以及共刺激分子和细胞因子的mRNA构建体，将受体细胞短暂重编程为"设计型APC"，从而进一步提升mRNA疫苗的效力。该策略通过功能上重编程被转染的细胞，使其获得关键的免疫刺激特性，弥补了传统上依赖天然APC亚群的不足，为抗原呈递提供了另一条途径。这些设计型APC能够直接激活CD8⁺ T细胞，并协调产生强烈的细胞毒性免疫反应。此外，用IL-12等细胞因子替代IL-2，可实现抗原特异性Th1辅助T细胞在体内的分化，凸显出该策略可根据具体环境精确调控T细胞分化的潜力。

用于激活抗原特异性CD8⁺ T细胞的定制APC的生成

为了设计能够激活抗原特异性CD8⁺ T细胞的工程化APC，合成了一系列编码OVA-MITD（一种包含OT-I和OT-II表位的模型抗原，并融合了最小MHC I类分子转运结构域（MITD）以增强抗原呈递）、共刺激分子CD80以及膜锚定IL-2（通过将IL-2与CD8α的胞外域融合实现）的mRNA。用于体外转录的质粒经过改造，包含128个核苷酸长度的poly(A)尾以提高稳定性，并使用m¹ΨTP替代UTP（图1a，图S1a-c）。这些mRNA被转染至MC38细胞后，流式细胞术检测显示MHC I、CD80和IL-2在细胞表面高效表达（图1b,c），表明MC38细胞已成功重编程为同时呈递抗原、共刺激分子和细胞因子的"设计型APC"。当与OVA特异性的CD8⁺ T细胞（OT-I）共培养时，表达OVA-MITD、CD80和IL-2三种成分的MC38细胞诱导了最强的OT-I细胞增殖，显著优于仅表达OVA-MITD或与CD80或IL-2任一组合表达的细胞（图1d,e，图S1d,e）。

图1 用于激活抗原特异性CD8⁺ T细胞的定制APC的生成

图S1 设计型APC介导的CD8⁺ T细胞刺激

体内生成设计型APC可刺激抗原特异性CD8⁺ T细胞

检测了在体内生成设计型APC是否能够促进内源性抗原特异性CD8⁺ T细胞的克隆扩增。小鼠每周一次分别接受对照mRNA、单独OVA-MITD mRNA，或OVA-MITD、CD80与IL-2 mRNA混合物，连续给药三周。所有mRNA均采用in vivo-jetRNA⁺脂质体递送试剂进行制剂化，以实现高效的全身递送。末次注射一周后，取脾脏并通过MHC I类tetramer检测OVA特异性CD8⁺ T细胞（图2a）。与体外实验结果一致，联合组中OVA-tetramer⁺ CD8⁺ T细胞的扩增程度（56%）明显强于OVA-MITD单用组（24.3%）（图2b,c，图S2a）。扩增的CD8⁺ T细胞呈现CD44hiCD62Llow表型，具有效应T细胞或效应记忆T细胞的特征，并表达IFN-γ（图2d，图S2b,c）。各组间总脾细胞数量相当（图S2d），表明观察到的OVA特异性CD8⁺ T细胞扩增并非由非特异性激活引起，而是反映了靶向性的免疫应答。

为评估治疗效果，采用了一种肿瘤模型，将表达OVA的E.G7细胞（OVA表达型EL-4衍生细胞）皮下植入C57BL/6小鼠体内。当肿瘤体积达到100mm³时，小鼠每周接受一次静脉注射，分别给予对照mRNA、单独OVA-MITD mRNA或联合制剂，持续三周（图2e）。与对照组相比，OVA-MITD mRNA单药治疗延缓了肿瘤生长并延长了生存期，而联合治疗则表现出更强的肿瘤抑制作用和更长的生存期（图2f,g）。

为阐明其潜在机制，在给予mRNA一周后分析了肿瘤浸润性淋巴细胞（图2h）。OVA-MITD组中CD8⁺ T细胞占TILs的4.6%，而在联合治疗组中上升至13.5%（图2i,j，图S2e-g）。与此一致，联合治疗组的肿瘤重量显著降低（图S2h）。此外，联合治疗组中有更高比例的CD8⁺ T细胞表达IFN-γ（图2k），表明肿瘤微环境中CD8⁺ T细胞的浸润和活化增强。这些结果表明，在体内生成的工程化APC可扩增抗原特异性的CD8⁺ T细胞，并在OVA抗原模型中引发强烈的抗肿瘤免疫反应。

图2 体内生成设计型APC可刺激抗原特异性CD8⁺ T细胞

图S2 设计型APC诱导脾脏和肿瘤中抗原特异性CD8⁺ T细胞的活化

体内生成定制APC可扩增新抗原特异性CD8⁺ T细胞

以Rpl18作为MC38肿瘤系统中的模型新抗原，研究了在体内生成设计型APC是否能够扩增新抗原特异性的CD8⁺ T细胞。小鼠每周一次接受对照mRNA、单独的Rpl18-MITD mRNA，或Rpl18-MITD、CD80和IL-2 mRNA混合物，连续三周，给药方案依据OVA模型建立的流程（图3a，图S3a）。末次注射一周后，收集脾脏，利用MHC I类tetramer检测Rpl18特异性的CD8⁺ T细胞。仅接受Rpl18-MITD的小鼠中，tetramer阳性CD8⁺ T细胞出现轻度扩增，而联合治疗则诱导了显著的扩增，并分化为CD44hiCD62Llow效应细胞和效应记忆表型（图3b-d，图S3b-d）。与OVA模型中观察到的结果一致，各组间总脾细胞数量保持不变（图S3e），表明该反应具有抗原特异性，而非非特异性激活所致。

为评估治疗效果，将Rpl18-MC38肿瘤皮下植入小鼠体内，并使其生长至约100mm³。按照与OVA模型相同的每周给药方案，小鼠每周接受一次对照mRNA、单独Rpl18-MITD或联合mRNA混合物治疗，持续三周（图3e）。尽管单独使用Rpl18-MITD仅轻微延缓了肿瘤生长，但联合治疗显著增强了肿瘤抑制作用并延长了生存期（图3f,g）。这些结果表明，体内生成的定制APC不仅能促进针对新抗原的CD8⁺ T细胞扩增和功能分化，还能增强抗肿瘤免疫反应，相较于仅含抗原的mRNA疫苗，在改善生存方面具有更优效果。

图3 体内生成定制APC可扩增新抗原特异性CD8⁺ T细胞

图S3 通过设计型APC激活新抗原特异性CD8⁺ T细胞

人源化设计APC诱导的HLA-A*02:01限制性反应的体内与体外评估

为了在HLA-A*02:01限制性人源化小鼠模型中评估设计型APC的功能，采用了HHD小鼠，这类小鼠表达一种嵌合的MHC I类分子，该分子由人HLA-A*02:01的α1和α2结构域、小鼠H-2Db的α3结构域以及人β2M组成。该模型可用于在体内评估HLA-A*02:01限制性的CD8⁺ T细胞反应。选择NY-ESO-1作为代表性肿瘤抗原，这是一种在多种恶性肿瘤中广泛表达的癌症/睾丸抗原，并采用其已被充分表征的HLA-A*02:01限制性表位（氨基酸157-165）。小鼠分别接受仅编码NY-ESO-1-MITD的mRNA，或联合编码NY-ESO-1-MITD、CD80和IL-2的mRNA治疗（图4a，图S4a）。单独使用NY-ESO-1-MITD mRNA未能诱导抗原特异性CD8⁺ T细胞的显著扩增，而联合治疗则导致CD44hiCD62Llow效应/记忆型CD8⁺ T细胞的强烈扩增与分化（图4b-d，图S4b-d）。与先前结果一致，各组之间脾细胞总数保持不变，表明为抗原特异性激活（图S4e）。为了评估细胞毒性活性，在末次注射后7天，将经NY-ESO-1肽段致敏（CellTrace Violet标记）和对照肽段致敏（CFSE标记）的脾细胞以1:1混合后注入mRNA处理的小鼠体内，进行体内杀伤实验（图4e）。在接受mRNA混合物治疗的小鼠中，NY-ESO-1肽段致敏的靶细胞被选择性清除，而在接受对照mRNA或仅NY-ESO-1-MITD mRNA的小鼠中则未见此现象（图4f,g）。这些结果表明，在体内生成的设计型APC能够在HLA-A*02:01限制性环境下有效诱导功能性抗原特异性CTL反应。

在HHD小鼠模型中进行体内评估后，接下来通过使用来自HLA-A*02:01阳性供体的TCR转导人原代PBMC进行体外共培养实验，考察设计型APC在完全人源环境中的功能。通过慢病毒转导将一种针对NY-ESO-1的TCR导入来自HLA-A*02:01阳性健康供体的PBMC中。随后，将对照mRNA、单独的NY-ESO-1-MITD mRNA，或NY-ESO-1-MITD、人CD80及膜锚定型人IL-2 mRNA的组合分别转染至HEK293T细胞，以生成设计型APC（图4h，图S4f,g）。当与经TCR工程改造的T细胞共培养时，仅表达全部三种组分的设计型APC能够诱导强烈的T细胞活化，表现为抗原特异性T细胞扩增以及IFN-γ的产生（图4i,j，图S4h,i）。

图4 人源化设计型APC的生成可激活针对NY-ESO-1的CD8⁺ T细胞

图S4 人源化设计型APC激活抗原特异性CD8⁺ T细胞

体内生成设计型APC可诱导抗原特异性CD4⁺ T细胞向Th1分化

为了拓展设计型APC在激活CD8⁺ T细胞之外的功能，构建了促进抗原特异性CD4⁺辅助T细胞分化的分子元件。设计了编码膜锚定IL-12的mRNA，以及一种融合蛋白的mRNA，该融合蛋白由OVA肽段通过柔性连接子与MHC II类分子（MHC-II）I-Ab相连，从而实现无需细胞内加工的直接表位呈递（图5a，图S5a,b）。小鼠每周静脉注射一次OVA-MHCII mRNA单独制剂或OVA-MHCII、CD80与IL-12 mRNA的联合制剂，连续给药两周。末次注射一周后，取脾脏并通过流式细胞术使用MHC-II tetramer检测鉴定OVA特异性CD4⁺ T细胞（图5b）。仅接受OVA-MHCII mRNA的小鼠中，抗原特异性CD4⁺ T细胞仅有轻微扩增；而接受联合mRNA制剂的小鼠中，MHC-II tetramer⁺ CD4⁺ T细胞的比例显著升高（图5c,d，图S5c,d）。在这些细胞中，27%表达T-bet，即Th1细胞分化的关键调控因子（图5e,f，图S5e）。此外，在体外用OVA肽段刺激后，联合组来源的大量CD4⁺ T细胞产生IFN-γ，证实其具备功能性Th1极化特征（图5g，图S5f）。结果表明，体内生成表达MHC-II连接抗原与IL-12的设计型APC，可有效促进抗原特异性CD4⁺ T细胞的扩增及其向Th1亚型的分化。

图5 体内生成的工程化APC可诱导抗原特异性CD4⁺ T细胞向Th1分化

图S5 设计型APC诱导Th1细胞

总结

这里研究证明，共递送编码抗原、共刺激分子和免疫调节细胞因子的mRNA可暂时将非专业的体细胞在体内重编程为设计型APC，从而显著增强新抗原特异性CD8⁺ T细胞的活化与扩增，克服了传统mRNA癌症疫苗免疫原性低及新抗原预测困难等挑战。此外，结果表明，可通过调节mRNA混合物中的细胞因子组分来引导CD4⁺ T细胞的分化。例如，加入IL-12可选择性促进抗原特异性CD4⁺ T细胞向Th1极化。近期多项研究探讨了IL-12 mRNA作为单独佐剂的应用。有研究显示，将独立的IL-12 mRNA-LNP与编码抗原的mRNA-LNP联合使用可增强CD8⁺ T细胞的扩增和效应分化，但CD4⁺ T细胞辅助作用仍然有限。有研究通过在佐剂mRNA结构中锚定膜结合型IL-12实现了更强的Th1偏向，但其效果仍依赖内源性DC细胞实现最佳启动。与两瓶装的IL-12 mRNA佐剂方案不同，由抗原、CD80和膜结合IL-12组成的设计型APC mRNA混合疗法，有效诱导了内源性OVA特异性CD4⁺ T细胞的体内扩增和Th1极化，表现为T-bet表达和IFN-γ分泌。这些发现凸显了设计型APC平台在引导抗原特异性辅助T细胞反应方面的高效性与模块化优势。

除了IL-12之外，引入IL-15或IL-21可增强记忆前体CD8⁺ T细胞，而共表达4-1BBL或OX40L等共刺激分子则可能进一步放大效应功能。这些发现凸显了该平台的模块化特性：通过抗原、共刺激分子和细胞因子的定制化组合，可精细调节T细胞反应以满足特定需求。除癌症疫苗外，该方法还可通过共编码抑制性细胞因子或其他调控信号，应用于诱导自身免疫病或过敏性疾病中的抗原特异性耐受。通过进一步优化mRNA载荷，还可探索其他应用，例如诱导长效记忆T细胞或避免T细胞耗竭。因此，设计型APC为多种疾病背景下的免疫调节提供了一个灵活且精确的平台。

该研究中，采用市售脂质体进行mRNA递送，有效促进了受体细胞的摄取和表达。然而，使用更先进的递送载体，如针对DC细胞设计的LNP或LPX，可能进一步提高转染效率和治疗效果。近期研究表明，靶向DC细胞的LPX（如BNT111等）可增强抗原呈递和抗肿瘤免疫。除脂质载体外，病毒样颗粒、聚合物-脂质杂合纳米颗粒以及工程化细胞外囊泡也是具有潜力的递送平台，有望提升载荷稳定性、细胞特异性和内涵体逃逸能力。将设计型APC mRNA平台与先进递送系统相结合，可能通过提高mRNA向免疫相关细胞群体递送的精确性和效率，进一步增强抗肿瘤免疫反应。

尽管这些优势引人注目，但设计型APC引发的强烈免疫激活也带来了安全性方面的考量。促炎性细胞因子过度或系统性表达可能引发CRS或脱靶组织损伤。因此，严格的剂量探索研究以及组织限制性递送将成为未来转化研究中的关键环节。

总之，该研究建立了一种新颖且模块化的基于mRNA的平台，用于在体内生成设计型APC，从而实现对抗原特异性T细胞反应的精确激活与编程。这项工作为今后在癌症免疫治疗和免疫调控领域中优化mRNA制剂、先进递送系统、安全性工程以及转化应用的研究奠定了基础。

Aunins, E. A. et al. An Il12 mRNA-LNP adjuvant enhances mRNA vaccine-induced CD8 T cell responses. Science Immunology 10, eads1328 (2025).

Yaremenko, A. V., et al. Clinical advances of mRNA vaccines for cancer immunotherapy. Med 6, 100562 (2025).

Toan Van Le, et al. mRNA-Based Designer APCs Elicit Robust CD8⁺ and CD4⁺ T Cell Responses. BioRxiv (2025).

Guo, J. et al. IL-15 functionalized biomimetic hybrid mRNA vaccine for enhanced NSCLC immunotherapy via synergistic activation of T cells and NK cells. Materials Today Bio 32, 101914 (2025).

Maeki, M. et al. Development of Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles for Large-Sized Plasmid DNA Transfection. ACS Appl Mater Interfaces 16, 2110-2119 (2023).