SAR444200，新型抗GPC3纳米抗体TCE

T细胞衔接剂（TCE）免疫疗法通过同时结合T细胞和肿瘤细胞，诱导T细胞活化以及T细胞依赖性细胞毒性（TDCC）来杀伤肿瘤细胞，在多种癌症中已显示出显著的临床活性。目前的TCE主要采用基于抗体的结合结构域，分别靶向T细胞上TCR/CD3复合物中的CD3e分子以及肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原。然而，该方法存在一些局限性，包括CRS和较窄的治疗窗口。这里，赛诺菲研究院报道了SAR444200的生成及临床前评估，这是首个基于纳米抗体的TCE临床候选药物，可同时结合TCRαβ和GPC3，共同激活T细胞与GPC3阳性肿瘤细胞，从而引发TDCC。SAR444200与TCRαβ和GPC3分别以nM至pM亲和力结合，并在体外对多种具有不同GPC3表达水平的人肿瘤细胞系诱导出皮摩尔效力的TDCC。在免疫缺陷小鼠中使用人癌细胞系（HuH-7和HepG2）来源的异种移植模型进行的体内分析显示，从0.7mg/kg剂量起即可实现完全肿瘤消退。在探索性非人灵长类动物研究中，静脉给予SAR444200在高达8mg/kg剂量下耐受性良好，在测试剂量范围内表现出大于剂量比例的清除率和与剂量成比例的最大浓度。SAR444200在多种GPC3+肿瘤模型中表现出高强效活性，且耐受剂量范围极宽，值得对该化合物进一步开发。此外，采用抗TCRαβ部分开发的基于纳米抗体的TCE可能在TCE开发中具有特定优势。

GPC3是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，属于glypican家族成员。GPC3功能缺失性突变可导致Simpson-Golabi-Behmel综合征，一种X连锁过度生长疾病。GPC3的表达与多种儿童恶性肿瘤及成人实体瘤相关，包括肝细胞癌（HCC）。在HCC中，GPC3的mRNA和蛋白水平显著高于非恶性肝脏病变及正常组织。其他肿瘤类型中也报道有GPC3的过表达，如肝母细胞瘤、肺鳞状细胞癌和黑色素瘤。尽管血清样本中可检测到可溶性GPC3，但其在全身循环中的水平在不同患者间差异较大，限制了其在HCC诊断中的应用价值。

GPC3在多种肿瘤中的过表达使其成为治疗干预的潜在靶点，包括治疗性抗体和TCE疗法。已知的TCE是多特异性分子，包含一个CD3结合域和一个TAA结合域；同时结合T细胞上的CD3和肿瘤细胞上的TAA可形成人工免疫突触，从而引发MHC非依赖性的免疫反应。

T细胞的活化及随后的肿瘤溶解活性。由于抗体骨架的存在，基于抗体的技术具有不同的空间结构和靶标结合亲和力，这可能影响其治疗活性以及风险/获益比。无论采用何种形式，双特异性TCEs均以单价方式结合CD3，以避免TCR聚集以及不依赖于TAA共结合的T细胞激活。只有当TCEs结合到表达特定密度肿瘤特异性靶标的肿瘤细胞时，才会促进TCR/CD3复合物的多价结合，从而通过TCR聚集激活T细胞，并绕过MHC限制性激活途径。目前大多数新一代TCEs具有类似抗体的结构，并包含可结晶片段（Fc）区域；然而，为了减少脱靶的CD3聚集并改善T细胞向肿瘤部位的迁移，通常会沉默Fc区域的效应功能。

纳米抗体分子缺少Fc结构域，由仅含重链抗体的可变区（VHH）构成，具有作为治疗和诊断制剂构建模块的理想特性：分子小、易于连接多个功能单元、良好的溶解性和稳定性、易于生产以及深层组织穿透能力。

这里，描述了首个靶向GPC3阳性实体瘤的基于纳米抗体的TCE分子的生成及其临床前表征。为了实现对GPC3的强效结合，引入了两个双价高亲和力纳米抗体结合分子，它们分别与GPC3上的两个不同表位相互作用。为激活T细胞，采用了一种新近报道的TCRαβ结合纳米抗体分子，并结合一个人血清白蛋白（HSA）结合纳米抗体分子，以延长其血清半衰期。推测，相较于抗体骨架，该基于纳米抗体的TCE分子具有特定的药理学特征、较低的分子量以及独特的生物物理性质，适用于实体瘤治疗，并可配制成高浓度制剂用于皮下（SC）给药，从而实现可接受的风险/获益比。

SAR444200（一种抗GPC3、半衰期延长的纳米抗体TCE）的研制

通过连接TCRαβ和GPC3纳米抗体结构模块，并加入人源SA结合纳米抗体分子模块以延长多特异性分子的半衰期，设计了一种靶向GPC3的TCE（图1）。在对GPC3纳米抗体结合物的初步筛选中，鉴定出4个结合表位分组；其中来自两个不同表位分组的A0226015A08和A0226018C08 纳米抗体分子被选用于构建双原表位的GPC3结合剂。这两种分子与已报道的、具有已知表位的任何GPC3抗体均不竞争结合GPC3。利用瞬时转染的HEK293T细胞进行的结合研究显示，A0226018C08和A2206015A8均能结合全长GPC3；然而，只有A0226018C08（而非A2206015A8）能够结合GPC3的C端结构域（S359-H580），证实了二者识别不同的GPC3结合位点。

图1 A0226015A08和A0226018C08纳米抗体在GPC3和TCR靶蛋白上识别的不同表位。

使用A0226018C08和A0226015A08生成了多种具有半衰期延长的TCEs，这些TCEs具备单价或双价（单向或双向）结合GPC3的能力，并在构建模块之间采用不同长度的连接子，随后在HuH-7细胞中进行了TDCC实验（表1）。目的是定性描述不同分子在效价和/或效能上的差异，从而为双特异性分子的最佳结构提供参考。

表1 针对抗GPC3纳米抗体TCE分子的候选分子结构优化

当TCR结合结构单元（TCE01）或白蛋白结合结构单元（ALB23002）的位置发生变化时，分子功能受到显著影响。位于N端时，TCE01能够有效杀伤肿瘤细胞（例如A02260167 vs A02260178，杀伤率达90% vs 无效应）；而位于C端时，ALB23002表现出更强的TDCC活性（A02260172 vs A02260174，杀伤率为90% vs 99%）。

双价GPC3结合构建体在杀伤HuH-7细胞方面表现出比单价GPC3结合构建体更强的效力（例如A02260179 vs A02260174；效力差异高达100倍）。在单价GPC3结合构建体中，不同长度的连接子降低了杀伤靶细胞的比例（例如A02260167 vs A02260179，分别为91% vs 61%）；但不同长度的连接子对双价构建体的GPC3结合能力无明显影响（例如A02260174与A02260175，结合能力均为99%）。A022600174是表现出高杀伤效力的纳米抗体分子之一，其IC50值为62.6pM，靶细胞杀伤率达100%，因此被选中进行人源化优化，并去除潜在的翻译后修饰风险位点，同时保持其GPC3结合能力。经序列优化后的A022600174被命名为SAR444200。

图SD1 SAR444200的氨基酸序列

抗TCRaβ和抗GPC3纳米抗体构建模块表位结合的结构测定

解析TCE01与TCRαβ复合物的3.4Å分辨率冷冻电镜结构。为了精确构建该模型，解析了TCE01的晶体结构，并将其对接到大复合物的冷冻电镜密度图中。观察到TCE01结合在TCRα的143N-157K和189N-191I以及TCRβ的175Q-185D组成的表位上。TCE01的N端结构域插入在TCRα的V区和C区之间，导致其N端结构域没有空间进行融合，从而支持当前的设计方案，即TCE01位于N末端时表现出最高的结合力/活性。TCE01的C端结构域暴露且具有柔性，便于与靶向GPC3的结合模块通过连接子进行融合。

GPC3/A0226015A08和GPC3/A0226018C08共复合物的冷冻电镜结构分辨率分别为4.7Å和6.6Å。A0226015A08结合于GPC3的中央区域，而A0226018C08则结合于靠近GPC3C末端区域的一个表位，这与细胞结合分析结果一致。尽管在当前分辨率下无法精确确定表位位置，但观察到A0226018C08的密度位于N470-S477和S302-L306残基附近。还使用Alphafold构建了纳米抗体模型，并将其对接至实验密度中。这些模型预测A0226018C08具有一个延伸的CDR3，与冷冻电镜密度相符（即单一环状密度负责结合）。此外，观察到结合GPC3的A0226018C08存在构象异质性，这可能是因为CDR3是主要的结合决定因素，且该CDR3环具有一定灵活性（图1）。

SAR444200 GPC3纳米抗体TCE与人和食蟹猴靶蛋白结合的动力学及结合参数

通过SPR测定了SAR444200对人和食蟹猴GPC3、TCRαβ及SA的亲和力。TCRα和TCRβ链的胞外域与一段拉链肽融合以实现二聚化。结果以KD表示，详见表2。同时评估了其对小鼠GPC3和SA的亲和力。TCRαβ纳米抗体分子不与小鼠TCR发生交叉反应。

SAR444200对人和食蟹猴TCRαβ的亲和力分别处于个位数纳摩尔和亚纳摩尔范围，对GPC3的亲和力也表现出类似水平（表2）。在两个物种中，各靶点的亲和力相似，表明人与食蟹猴同源蛋白之间具有良好的交叉反应性。SAR444200对人和食蟹猴白蛋白的亲和力也保持良好，提示在这两个物种中可能具有相似的半衰期延长效果。而对小鼠GPC3和白蛋白的亲和力则低于相应的人源蛋白，这与这两个物种之间的较低同源性一致，提示SAR444200的药理学和药代动力学特征在该物种中可能无法完全保留。

表2 SAR444200与人、食蟹猴和小鼠GPC3及白蛋白，以及人和食蟹猴TCRαβ结合的 KD值（M）

SAR444200对表达人和非人灵长类动物GPC3的细胞系的体外 TDCC

通过将来自多个供体的原代人T细胞与不同表达水平GPC3的"靶"细胞共培养，并利用实时阻抗检测定量靶细胞存活率，评估了SAR444200的TDCC。

细胞系panel中GPC3的表达水平从高（HepG2）到中等（NCI-H661、HuH-7）再到低（NCI-H23）不等，流式细胞术和ICC结果一致（表3）。在实验条件下，通过免疫染色无法检测到NCI-H23细胞系上的GPC3表达，其计算H评分仅为0（与非肿瘤性健康细胞相当）。转染cyGPC3的HEK293细胞经流式细胞术分析显示为中等水平表达。

SAR444200 对经IHC染色检测为GPC3阳性（H评分>0）的细胞表现出完全杀伤作用，并显示出亚纳摩尔级别的效力（以EC50表示），与母体分子A022600174相当（表1和表3）。在NCI-H23细胞中未观察到TDCC效应，表明SAR444200对GPC3表达具有特异性，该结果与IHC染色结果一致，且流式细胞术检测显示其表达水平高于1406个GPC3/细胞。

根据其结合谱，SAR444200对食蟹猴GPC3表现出交叉反应性，并可在表达猴源GPC3同源物的重组细胞上诱导cyT细胞介导的TDCC（表3）。

表3 T细胞对不同GPC3表达水平细胞系的化合物介导的细胞毒性活性。

SAR444200体内抗肿瘤疗效

在两种人源化小鼠模型中评估了SAR444200的抗肿瘤活性，这些模型使用HCC HuH-7和HepG2人源细胞系植入NOG小鼠，并注射体外扩增的人源T细胞。首先，确定了在携带肿瘤并注射人源T细胞的NOG小鼠中，静脉给予0.2-2mg/kg剂量的SAR444200后的药代动力学特性。其半衰期约为1天，清除率为1.85-2.03 mL/h/kg。在小鼠中观察到的药物暴露量超过TDCC试验中产生活性所需的效应浓度（EC50），且持续至少3天，这支持了体内药效研究的给药方案。

在此条件下，与对照组T017000698相比，给予SAR444200剂量为0.7mg/kg和2mg/kg时，在HepG2人源化肿瘤模型中观察到显著的抗肿瘤活性。T017000698是一种多特异性纳米抗体，可结合T细胞上的TCRαβ和人血清白蛋白，给药时间为第28天至第33天。在第28、31和33天均观察到具有统计学意义的差异（p<0.0001），在第33天的%ΔT/ΔC（即每只动物在每次治疗开始至指定观察日之间，各治疗组[T]和溶剂对照组[C]相对于基线的肿瘤体积变化）为0（图2A）。在0.7mg/kg剂量下观察到1例CR和3例PR；在2mg/kg剂量下观察到1例CR和5例PR（图2A）。

在0.7mg/kg SAR444200处理的人源化HuH-7肿瘤模型中，自D28至D35与对照组T017000698处理的小鼠相比显示出显著的抗肿瘤活性（D28，p=0.0453；D31，p=0.0007；D33，p<0.0001；D35，p<0.0001），在D35时%ΔT/ΔC为0。在此剂量下，观察到3个CR和1个PR。此外，在2mg/kg SAR444200处理的人源化小鼠中，与对照组T017000698处理的小鼠相比，在D33（p=0.0321）及研究终点D35均显示出显著的抗肿瘤活性，D35时%ΔT/ΔC为33（p=0.0018）。在此剂量下，观察到1个CR和3个PR（图2B）。

给予0.2mg/kg SAR444200在两种肿瘤模型中相较于对照组T017000698给药小鼠均未表现出显著的抗肿瘤活性，HepG2肿瘤模型在D33时%ΔT/ΔC为71，HuH-7肿瘤模型在D35时为46（p值分别为0.4884和0.1763；图2A和2B）。

监测小鼠体重以评估对治疗的耐受性。在任一肿瘤模型中，治疗后或任何给定剂量下均未观察到体重下降。

图2 使用HepG2和HuH-7人源化肿瘤模型评估SAR444200的抗肿瘤疗效。

SAR444200在食蟹猴中的药代动力学和安全性特征

通过食蟹猴的单剂量和重复剂量研究，评估了SAR444200的药代动力学和安全性特征。在向雌性猴子单次静脉输注（剂量：0.003-7mg/kg）后，药物最大浓度通常出现在输注结束时，并随剂量成比例增加（图3）。清除率为0.734-1.88 mL/h/kg，终末半衰期为22.1-55.2小时。观察到的清除率随剂量增加而降低，提示存在靶点介导的药物处置。皮下给药后，平均最大药物浓度出现在24小时后，平均终末半衰期为29.5小时；皮下生物利用度平均为95%。在所有剂量水平下，SAR444200均耐受良好，未出现死亡、与治疗相关的临床体征或体重变化。

图3 雌性猴单次静脉输注或皮下给药后SAR444200的血清浓度曲线。

在重复给药方案中，经过递增剂量（1-2.4-8mg/kg）后，每周两次静脉输注8mg/kg、持续30分钟的方案耐受性良好。在8mg/kg剂量下第29天的药物暴露量与1mg/kg剂量下第1天成比例，提示在8mg/kg重复给药后无明显蓄积。未观察到死亡率、治疗相关的临床症状或体重变化。SAR444200引起淋巴细胞计数短暂下降和活化T细胞亚群增加，这与TCE的作用机制一致。此外，SAR444200仅引起IL-2和IL-6水平的短暂且中等程度升高，与其他TCE观察到的情况相似，但重复给药后细胞因子反应有所减弱。

总结

双特异性TCE免疫疗法提供了一种强大的机制，可重定向T细胞以杀伤肿瘤细胞，目前已有多种通过该机制展现抗肿瘤活性的分子正在临床研究中用于实体瘤和液体瘤的治疗。SAR444200，一种新型、四价、半衰期延长的双特异性纳米抗体TCE，可在体外和体内诱导对GPC3+肿瘤细胞的TDCC。SAR444200是首个靶向该TAA的纳米抗体 TCE，目前正在一项针对晚期实体瘤患者的1/2期临床研究中进行评估（NCT05450562）。该分子采用了一种独特的抗-TCRαβ纳米抗体结构域，此前已在靶向CD33和CD123的TCE中被报道。

GPC3是肝细胞癌、鳞状细胞肺癌及其他实体瘤免疫治疗的已验证靶点。目前针对GPC3最先进的项目包括CAR-T细胞和双特异性TCE，例如ERY-974和CM-350。然而，这些方法迄今尚未推进至临床开发的后期阶段，提示在GPC3阳性肿瘤细胞高发的适应症中迫切需要新的治疗手段。尽管CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中取得了显著进展，但在实体瘤治疗中仍面临特定挑战，包括T细胞向肿瘤迁移和浸润困难，以及不利的肿瘤微环境，这需要复杂的策略来加以克服。相比之下，像ERY-974这类TCE的给药剂量可能受到安全性的限制，如CRS。在针对晚期实体瘤患者开展的首个ERY-974剂量递增研究中，观察到了剂量限制性毒性，导致其最大给药剂量被限制在0.81μg/kg。尽管可通过预处理和联合用药等策略减轻CRS，但实现足以产生充分治疗效果的高剂量仍具挑战性。

由于仅报道了少数基于纳米抗体的TCE，且只有SAR444200处于临床评估阶段，因此迫切需要评估这种生物模式是否为此类疗法带来显著优势。

双特异性TCE中针对CD3或T细胞结合臂的表位亲和力与多样性对于新一代TCE的设计至关重要，因为它们会影响药物的体内分布和暴露量。这里选用纳米抗体分子，以确保对TCRαβ复合物具有相对较高的亲和力，同时在肿瘤细胞上的GPC3之间保持足够大的亲和力差异。SAR444200对TCRαβ的亲和力处于低纳摩尔范围，显著高于已报道的OKT3 Fab片段对CD3εγ的亲和力，但仍处于其他TCE所采用的合理范围内，并且高于影响体内分布的负向阈值。

SAR444200的药理特性严格依赖于纳米抗体结构单元及其分子排列顺序和间距。这一发现证实了纳米抗体分子所采用的模块化策略具有高度灵活性，同时也凸显了分子构型在构建高效纳米抗体治疗药物中的关键作用。缩短纳米抗体结构单元之间的连接子长度可提升分子活性，且通过双表位设计将对GPC3的亲和力优化至亚纳摩尔范围。利用冷冻电镜技术，进一步确认并阐明了TCRαβ 纳米抗体结构单元TCE01位于分子N端的关键位置，支持了SAR444200最终分子构型的选择。

尽管纳米抗体分子的N端预计会暴露于溶剂中，因为其抗原结合位点位于该末端，但本研究中观察到的高敏感性可能与TCRαβ复合物上所靶向的特定表位有关。TCE01的N端紧密插入TCRαβ的可变区与恒定区之间；在TCE01的N端插入额外的分子实体将破坏其与靶蛋白的结合。

结果显示，SAR444200在体外对表达高水平GPC3的肿瘤细胞具有特异且强效的杀伤作用。相比之下，在NCI-H23细胞上未观察到肿瘤杀伤效应，这些细胞通过流式细胞术检测显示GPC3表达水平极低，且在实验条件下免疫组化检测未见可检测信号。还观察到，携带GPC3阳性HCC异种移植瘤的小鼠能够耐受SAR444200治疗，并在两种人源化肿瘤模型（HuH-7和HepG2）中表现出显著的抗肿瘤活性，记录到了完全缓解和部分缓解。该效应与SAR444200介导的T细胞激活密切相关，因为作为对照、半衰期延长的靶向T细胞TCRαβ的纳米抗体（T017000698）在体外和体内均未引起任何对GPC3阳性肿瘤细胞的杀伤。

SAR444200在HuH-7人源化肿瘤模型中的活性在0.7mg/kg的中等剂量下似乎最高。多特异性TCE的有效性依赖于多个因素，包括肿瘤细胞上的靶点表达水平、对肿瘤细胞和T细胞上靶点的亲和力，以及肿瘤细胞对T细胞杀伤的敏感性。HuH-7细胞中GPC3的表达水平约为HepG2细胞的十分之一（表3）。这一结果提示，较低剂量的SAR444200可能已能达到有效杀伤肿瘤细胞的最佳暴露水平，例如0.7mg/kg剂量相较于2mg/kg剂量所表现出的效果。最高剂量可能导致有效的三聚体复合物比例降低。在HepG2肿瘤模型中，0.7mg/kg和2mg/kg两个剂量均有效，表明较高的GPC3表达水平可能需要更高剂量才能观察到明显疗效的下降。

探索性非人灵长类动物实验显示，SAR444200的暴露量低、清除率高、半衰期短，符合预期，且与其他TCEs观察到的情况相似，反映了靶点介导的药物分布特征。SAR444200在预计可产生充分药理效应的剂量下表现出良好的耐受性，在单次给药0.003-7mg/kg及重复给药高达8mg/kg的剂量范围内，其清除率和最大浓度均呈大于剂量比例的增加趋势。这与先前关于ERY-22（临床候选物ERY-974的替代分子）的研究形成对比，后者在1mg/kg剂量下即引发严重毒性。ERY-22的分子比例和受体占有率不太可能是导致毒性谱差异的原因。值得注意的是，按分子量差异校正后，SAR444200的给药剂量比ERY-22低超过100倍。尽管目前尚无关于ERY-22的直接数据，但已有文献报道ERY-974对CD3ε的亲和力为207.7nM，这一数值比SAR444200对TCRαβ的亲和力低数个数量级。

已有多个因素被发现与TCEs的风险/获益特征相关，但SAR444200在NHP中耐受性改善的主要原因尚不明确。对靶点的绝对和相对亲和力差异以及不同的功能特性可能与其T细胞结合部分的特异性有关。目前尚未发现TCEs（包括靶向CD3或TCR的DART分子）所诱导的T细胞活化模式存在根本性差异。然而，先前一项关于自身免疫疾病中免疫耐受诱导的研究报道，BMA031（TCRαβ结合剂）体外可诱导T细胞活化，但在给予患者后并未引起全身性不良反应，而OKT3（CD3结合剂）则导致了更严重的临床副作用，尽管两者诱导的TNFα和IFNγ水平相似。这被认为可能与激活了不同的信号通路，或TCRαβ的表达水平低于CD3ε有关，从而为探索TCRαβ作为T细胞结合的替代抗原提供了理论依据。

体外和体内研究中观察到的强效肿瘤细胞杀伤活性表明，SAR444200的疗效主要源于SAR444200-T细胞-肿瘤细胞复合物的形成，而不仅仅是SAR444200的暴露量。基于这一发现，采用机制性PK/PD模型来估算人体有效剂量，并支持其临床开发的启动。

综上所述，SAR444200良好的药代动力学特性、在多种GPC3+肿瘤模型中表现出的高效力和强效活性，以及较宽的耐受剂量范围，表明基于纳米抗体并采用抗TCRαβ部分开发的TCE是一种优于其他正在临床评估用于实体瘤治疗方式的理想选择。

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