特应性皮炎（AD）造模&检测完整解决方案

特应性皮炎（AD）是一种以表皮屏障受损、Th2偏倚炎症与瘙痒为核心特征的慢性复发性皮肤病。本文整合常用AD动物模型（MC903、HDM、OVA、OXA、DCNB及遗传/自发模型）与人源三维皮肤/类器官模型（RHE/FTSE、皮肤-on-chip、hiPSC皮肤类器官）的造模SOP、用剂、时间窗与读出指标要点等，以便快速落地于药效学筛选、机制验证与跨模态对照。

1、背景与研究意义

➸ AD的核心机制包括表皮屏障缺陷（如FLG/CLDN1下降）、角质细胞来源报警素（TSLP/IL33）、Th2优势炎症（IL4/IL13）以及微生物定植和超抗原加重，慢性期可见Th1/Th17参与 [1-3]。

➸ 针对不同科学问题（屏障-免疫互作、环境变应原触发、神经-瘙痒轴、微生物加重、遗传易感）选择合适模型与读出，对药效学与机制研究至关重要 [1-4]。

2、模型选型与应用场景

➸快速药筛、TSLP/Th2轴：MC903外用7-14天，稳定诱导TSLP/Th2炎症 [1,2]；

➸环境变应原与IgE：HDM经皮贴敷2-4周，可合并轻度屏障破坏；可加SEB模拟急性加重 [3,12-13]；

➸抗原特异性应答：OVA致敏+表皮激发，建立特异性IgE/IgG1与皮肤炎症 [4]；

➸慢性复发与免疫演替：OXA、DNCB反复挑战3-5周，苔藓样增厚明显 [5][14]；

➸遗传易感与自发病程：Nc/Nga、flaky tail（Tmem79/Flg缺陷）等 [6-7]；

➸人源机制与筛药：RHE/FTSE + IL4/IL13/HDM/SEB，或类器官/on-chip [8-12]。

3、动物模型SOP

3.1 MC903（calcipotriol）急性AD样皮炎模型

原理：维生素D类似物激活角质细胞，强诱导TSLP，驱动Th2炎症与瘙痒 [1-2]。

动物：C57BL/6或BALB/c，6-12周龄，雌雄均可。

关键试剂与材料

➸MC903（溶剂：乙醇或乙醇:丙二醇=7:3）；无菌棉签/微量加样器；

➸检测：卡尺、TEWL仪、ELISA、流式/免疫组化。

步骤与剂量（耳廓为例）

➸配制MC903工作液（避光）；使用前新鲜或短期4℃保存；

➸每日在双耳背侧各点涂1-4 nmol/耳（10-20 μL/耳），连续7-14天 [1]；

➸读出：耳厚、皮损评分、TEWL；H&E/甲苯胺蓝；FLG/LOR/IVL、CLDN1/ZO1、TSLP/IL4/IL13（IHC/IF、qPCR、ELISA）；血清总IgE；抓挠行为学 [1-2]。

注意事项：从低剂量起步，7-10天常见稳定表型；避免剂量过高致表皮溃破 [1]。

MC903特应性皮炎（AD）样模型造模流程 [1]

3.2 屋尘螨（HDM）经皮贴敷模型

原理：变应原与蛋白酶活性破坏屏障并致敏，诱导Th2/Th17混合炎症与IgE [3]。

关键试剂：HDM提取物（Dp/Df），PBS；屏障破坏材料（胶带或0.5-1% SDS）；可选SEB加重 [3,12-13]。

步骤（背部贴敷）

1. 剃毛并胶带剥离10-15次或0.5-1% SDS短时外涂后洗净 [3]。

2. 纱布片载HDM 100-500 μg/次（约100 μL PBS），半透贴膜固定24-72 h；每周2-3次，连续2-4周 [3]。

3. 可选：顶端加入SEB 0.1-1 μg/mL短时暴露以模拟细菌超抗原加重 [12-13]。

4. 读出：皮损评分、TEWL、总/抗HDM特异性IgE；皮肤与引流淋巴结流式；炎症与趋化因子谱[3]。注意事项：不同批次HDM的蛋白酶/内毒素差异大，建议先小试确定载量与周期 [3]。

3.3 卵清蛋白（OVA）致敏+表皮激发模型 [4]

原理：蛋白变应原经皮致敏与/或系统致敏后激发，诱导特异性IgE与皮肤炎症。

两种路径：

➸纯表皮致敏：背部胶带剥离后贴敷OVA 100-500 μg/次（100 μL PBS），持续1周；间歇1周后重复2-3轮。

➸腹腔致敏+表皮激发：day 0与7腹腔注射OVA+明矾，day 14起表皮贴敷激发2-3周。

读出：皮损评分、总/OVA特异性IgE/IgG1；组织学与细胞因子谱。

注意事项：若特异性IgE不显著，优先采用"腹腔致敏+表皮激发"路径。

OVA致敏流程示意图 [4]

3.4 氧唑酮（OXA）慢性皮炎模型 [5]

原理：反复化学致敏与挑战，形成慢性苔藓样病灶；免疫谱从Th2向Th1/Th17演替。

步骤：

1. 致敏：5% OXA（丙酮:橄榄油=4:1）腹部单次外涂。

2. 挑战：1% OXA（丙酮:橄榄油=4:1）耳或背部，每2-3天一次，共3-5周。

读出：皮厚、H&E、5（神经纤维）、细胞因子谱（后期IFN-γ/IL-17A）。

注意事项：化学致敏剂需佩戴个人防护装备与通风，评分与采样尽量盲法与随机化。

氧唑酮诱导的 BALB/c 小鼠（10 次挑战）特应性皮炎（AD）样模型造模流程 [5]

3.6 DNCB诱导AD样模型 [14]

原理：DNCB（2,4 - 二硝基氯苯）是一种半抗原，其诱导 AD 模型的核心机制是通过皮肤致敏 - 激发循环引发 Th2 型免疫应答。

步骤：

1. 致敏： 1% DNCB 溶液（丙酮：橄榄油 = 3:1），背部涂抹，体积约 20-50 μL，连续 2-3 天。

2. 挑战：1% -0.5% DNCB（丙酮:橄榄油=3:1）耳或背部，每周2-3 次，持续 2-6 周。

读出：皮厚、H&E、5（神经纤维）、细胞因子谱（后期IFN-γ/IL-17A）。

DCNB诱导NC/Nga小鼠特应性皮炎（AD）样模型造模流程 [14]

3.7 遗传/自发模型概述

Nc/Nga：常规环境可自发AD样病变，适于长期慢性与微生物相互作用研究 [6]。flaky tail（Tmem79/Matt突变，常伴Flg异常）或Flg-/-（abs6112402）：屏障缺陷导致自发/诱发性皮炎易感 [7]。角质细胞TSLP过表达（K14-TSLP）等条件性模型用于验证表皮-免疫通路因果性 [2]。说明：遗传模型表型受微生物与环境影响显著，需标准化饲养与屏障条件 [6-7]。

4、人源三维/类器官模型SOP

4.1 重建人表皮/全层皮肤（RHE/FTSE）

原理与组成：原代人角质细胞与成纤维细胞；胶原I凝胶+Transwell；空气-液界面分化10-14天形成RHE（加成纤维细胞与凝胶为FTSE）[8]。

AD诱导策略

➸细胞因子：IL-4+IL-13各10-50 ng/mL，处理3-7天；可合并IL-31、TSLP或IL-33[9-10]。

➸变应原/毒素：顶端给HDM 10-100 μg/mL，或SEB 0.1-1 μg/mL [9-10,12-13]。

➸屏障基因操作：siRNA/CRISPR敲低FLG/CLDN1，或使用AD患者来源角质细胞 [9-10]。

关键读出：TEER、FITCdextran/Lucifer Yellow通透；分化/紧密连接蛋白（FLG/LOR/IVL、CLDN1/ZO-1）；趋化与报警素（CCL17/TARC、TSLP等）；转录组/蛋白组 [8-10]。

注意事项：保持ALI与温湿度稳定，TEER检测前平衡，避免温度漂移 [8]。

4.2 皮肤-on-chip微流控模型 [11]

原理与建模：将RHE/FTSE置入灌流微腔，上腔施加IL-4+IL-13或HDM/SEB刺激，下腔接入免疫细胞，在线监测TEER/通透与迁移。

适用：透皮药代、免疫迁移与急慢性切换研究；有利于模拟血流剪切力。

要点：稳定流速与供氧，避免气泡；可串联图像与电学传感。

微流控系统及传输系统模型 [11]

4.3 hiPSC皮肤类器官 [12]

原理：hiPSC经阶段性诱导（TGFβ/FGF通路调控）获得含表皮真皮毛囊/神经成分的皮肤类器官。

AD建模：成熟后处理IL-4/IL-13、HDM、SEB或导入FLG突变，表型化屏障与神经-免疫指标。

要点：培养周期（周-月）与批间差较大，需严格质控与标准化。

皮肤类器官诱导流程 [12]

5、读出指标与检测面板

功能/临床：耳厚/皮厚、皮损评分、TEWL（动物）；TEER、通透性探针（体外）。

组织与成像：H&E、甲苯胺蓝（肥大细胞）、IF/IHC/mIHC（KRT14/10、FLG/LOR/IVL、CLDN1/ZO-1、TSLP、PGP9.5）；必要时共聚焦/光谱拆分扫片仪。

免疫学：血清总/特异IgE；流式（Th2/ILC2/嗜酸粒/肥大细胞/树突状细胞）；细胞因子（IL-4/IL-6/IL -8/IL-13/IFN-γ/IL-17A等）。

分子与脂质：qPCR、RNA-Seq/单细胞、神经酰胺谱。

微生物：金黄色葡萄球菌定植与毒素（SEB）加重评估（CFU/毒素读出）。

6、阳性药物对照 [15]

单抗类药物：针对炎症因子或其受体的拮抗类单克隆抗体药物，阻断炎症因子与其受体结合，减轻炎症反应。

JAKi：抑制JAK-STAT信号通路激活，抑制炎症因子的产生和作用，从而减轻 AD 的炎症反应和瘙痒症状。

TRPV1 抑制剂：TRPV1 是一种非选择性阳离子通道，在角质形成细胞、肥大细胞和皮肤感觉神经中表达。以其为靶点的药物聚焦于阻断AD 患者的瘙痒信号传导。

芳香烃受体调节剂：芳香烃受体（AHR）是一种配体激活的转录因子，在角质形成细胞、免疫细胞（如树突状细胞、T 细胞）中高表达，参与调控皮肤屏障功能、免疫平衡及炎症反应。

AD治疗的新进展 [15]

7、质量控制与常见问题排查

模型成型不稳：核对原料批次（MC903/HDM）、屏障破坏强度（胶带次数/SDS浓度）、动物品系/周龄一致性；适度延长诱导周期 [1,3]。

IgE不升：优化致敏-激发间隔或采用"腹腔致敏+表皮激发"路径；或切换至HDM模型 [3-4]。

RHE/FTSE表型弱：提高IL-4/IL-13剂量或延长处理；合并HDM/SEB或FLG/CLDN1敲低增强表型 [9-10]。

瘙痒行为波动大：固定时段录像、提高帧率并盲法双评；增加样本量提升统计功效。

SEB加重导致坏死：降低剂量或缩短暴露，优先观察急性转录与趋化变化 [12-13]。

8、安全与伦理要点

1）动物实验遵循机构伦理，预先进行样本量估算、随机化与盲法评分；

2）化学致敏剂（OXA/DNCB）具刺激/致敏性，DNCB为危险品，操作需注意佩戴个人防护装备并做好环境通风；

3）体外原代细胞与人源样本遵循生物安全与知情同意规定。

参考文献：

[1] Alam, M. J., Xie, L., Yap, Y.-A., & Robert, R. (2023). A mouse model of MC903-induced atopic dermatitis. Current Protocols, 3,e695. doi: 10.1002/cpz1.695

[2] Li M, Messaddeq N, Teletin M, et al. Skin TSLP triggers Th2 responses through OX40L. Nat Commun. 2013;4:2847. doi:10.1038/ncomms3847.

[3] Martel BC, Lovato P, Bäumer W, Olivry T. Translational Animal Models of Atopic Dermatitis for Preclinical Studies. Yale J Biol Med. 2017 Sep 25;90(3):389-402.

[4] Spergel JM, Mizoguchi E, Brewer JP, et al. Epicutaneous sensitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to methacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice. J Clin Invest. 1998 Apr 15;101(8):1614-22. doi: 10.1172/JCI1647.

[5] Zeng L, Liu Y, Xing C, et al. Saponin from Periploca forrestii Schltr Mitigates Oxazolone-Induced Atopic Dermatitis via Modulating Macrophage Activation. Mediators Inflamm. 2020 Oct 15; 2020:4346367. doi: 10.1155/2020/4346367.

[6] Matsuda H, Watanabe N, Geba GP, et al. Development of atopic dermatitislike skin lesions with IgE hyperproduction in NC/Nga mice. Int Immunol. 1997;9(3):461-466. doi:10.1093/intimm/9.3.461.

[7] Saunders SP, Goh CS, Brown SJ, et al. Tmem79/Matt is a predisposing gene for atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 2013 Nov; 132(5):1121-9. doi: 10.1016/j.jaci.2013.08.046.

[8] Rimal R, Muduli S, Desai P, et al. Vascularized 3D Human Skin Models in the Forefront of Dermatological Research. Adv Healthc Mater. 2024 Apr;13(9):e2303351. doi: 10.1002/adhm.202303351.

[9] Danso MO, van Drongelen V, Mulder A, et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. J Invest Dermatol. 2014 Jul;134(7):1941-1950. doi: 10.1038/jid.2014.83.

[10] Cadau S, Gault M, Berthelemy N, et al. An Inflamed and Infected Reconstructed Human Epidermis to Study Atopic Dermatitis and Skin Care Ingredients. Int J Mol Sci. 2022 Oct 25;23(21):12880. doi: 10.3390/ijms232112880.

[11] Abaci HE, Gledhill K, Guo Z, et al. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab Chip. 2015 Feb 7;15(3):882-8. doi: 10.1039/c4lc00999a.

[12] Lee J, Rabbani CC, Gao H, et al. Hairbearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 2020;582(7812):399-404. doi:10.1038/s41586-020-2352-3.

[13] Faßbender S, Opitz FV, Johnen S, et al. MyD88 Contributes to Staphylococcal Enterotoxin B-Triggered Atopic Dermatitis-Like Skin Inflammation in Mice. J Invest Dermatol. 2017 Aug;137(8):1802-1804. doi: 10.1016/j.jid.2017.04.015.

[14] Choi JH, Song YS, Lee HJ, et al. The topical application of low-temperature argon plasma enhances the anti-inflammatory effect of Jaun-ointment on DNCB-induced NC/Nga mice. BMC Complement Altern Med. 2017 Jun 27;17(1):340. doi: 10.1186/s12906-017-1850-9.

[15] Schuler CF 4th, Billi AC, Maverakis E, et al. Novel insights into atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 2023 May;151(5):1145-1154. doi: 10.1016/j.jaci.2022.10.023.