可溶性蛋白原核表达全攻略

重组蛋白表达是现代生物技术与分子生物学中的核心技术之一。原核表达体系（以大肠杆菌为主）由于生长快、操作简便、成本低、产量高，一直是多数实验室首选。但在将外源蛋白在原核细胞中表达时，经常遇到的问题是蛋白折叠异常、形成包涵体、不稳定降解或低可溶性。为了克服这些难题，近年来研究者们提出了多种策略，从基因设计、载体构建，到菌株工程、表达调控、伴侣蛋白辅助、添加剂辅助等多个方向进行优化。

一、可溶性蛋白表达整体实验设计思路

1. 目标蛋白特性调研

查阅目标蛋白（或其同源蛋白）在文献中的表达情况，是否在原核系统已有成功报道。

分析序列特征：是否含有膜段、跨膜结构、信号肽、低复杂区、疏水区、二硫键、铁硫簇结合位点等。

利用软件工具对蛋白 "可溶性预测" 或 "聚集倾向" 进行初步评估，如 Aggrescan、PASTA、Protein-Sol 等。

2. 构建设计多个表达方案

多载体/多标签策略：选择几种不同融合标签（如 MBP、GST、SUMO、Trx、DsbC 等）与不同启动子或表达强度的载体进行平行试验。

多种菌株备选：如常规 BL21 (DE3)、C41 / C43、ArcticExpress、Origami / SHuffle、Lemo21 等。

设计并构建变体或截断版本（如剔除不稳定的N端或C端片段、去除低复杂区、引入少量突变以提高溶解性）。

初步小规模筛选：在 96孔或小瓶中测试多个条件（温度、诱导浓度、诱导时长等），找到可行条件后再扩大。

3. 逐步优化

从表达条件入手：温度、诱导浓度、诱导时间、培养基组成、添加剂等逐步优化。

辅助系统介入：共表达分子伴侣、调控表达速率、外源折叠助剂等。

规模化表达与验证阶段：Western blot、SDS-PAGE、可溶/不溶分离、活性检测、结构验证等。

二、影响可溶性表达的关键因素与优化策略

1. 蛋白本身工程：从基因到结构

1.1 截断与融合标签

部分蛋白若包含不稳定结构域或者低复杂区，可以尝试构造截短版本来减少折叠压力。

融合高溶解性标签（如 MBP、SUMO、Trx、GB1、DsbC 等）是常用且有效的手段。例如，MBP 标签能够显著提升下游蛋白的可溶性。

在一项结合 Golden Gate 克隆的表达系统中，研究者设计了一种模块化配置，可以灵活拼接不同标签（His / SUMO / MBP / GST / GB1）以增强溶解性与表达效率。

1.2 突变工程 / 同源重构

通过理性设计或定向进化，在不破坏功能的前提下引入表面极性或亲水残基替代疏水残基，降低聚集倾向。

利用祖先重构（ancestral reconstruction）或回溯性突变（atavistic mutations），将蛋白"回退"至更稳定的祖先版本，也是近年来文献中提出的策略。

1.3 密码子优化 / 翻译速率调整

目标基因应根据宿主的大肠杆菌偏好进行密码子优化，以避免因稀有密码子导致翻译停滞或掉帧。

但需要注意：过度追求"最高表达速率"可能带来折叠压力，导致更多包涵体。适度降低表达速率（例如引入少量稀有密码子、降低 T7 RNA 聚合酶活性等）常常有利于可溶性表达。

2. 载体 / 启动子 / 表达调控

2.1 选择合适启动子与复制子

经典的 T7 表达系统因其高转录效率被广泛采用。但对于敏感或易聚集蛋白，强启动子可能"表达过猛"导致折叠负担。因此可选择强度可调或诱导表达更温和的启动子（如 pBAD、lac、tac 等）或使用低拷贝载体。

2.2 表达调控系统

Lemo21 (DE3) 是一种可调控 T7 酶活性的系统，通过调节 T7 lysozyme 表达水平，从而间接控制目标蛋白的表达速率。

采用 pLysS / pLysE 协助抑制背景表达，有助于减小对宿主的毒性。

3. 选择合适宿主菌株

3.1 常用菌株

BL21 (DE3) 是最常用的表达宿主，具备较低的内源蛋白酶活性。

针对一些难表达蛋白（尤其在低温条件下折叠更好），ArcticExpress 杂合了冷源伴侣，有利于低温表达。

Origami / SHuffle 等菌株通过使胞内氧化还原状态更有利于二硫键形成，也适用于含二硫键或氧化折叠要求的蛋白。

3.2 耐受性调控与负载能力菌株

C41 (DE3) / C43 (DE3)（也称为 "toxic protein 耐受型"）因其对 T7 体系表达毒性蛋白的耐受性增强，常被用于膜蛋白或难表达蛋白表达。

还有一些设计从宿主代谢、基因调控网络层面介入，以减轻表达对宿主的负担。

4. 表达条件优化：温度、诱导、时间、培养基、添加剂

4.1 温度策略

常见做法是先在 37 °C 进行菌体培养以获得较高细胞密度，诱导后转低温（如 15-25 °C）表达，以减缓翻译速度、降低聚集风险。

4.2 诱导条件（诱导剂浓度、诱导时机与时间）

对于 IPTG 诱导体系，过高浓度可能导致表达过猛、包涵体增多；反之过低浓度可能表达产量太低。许多研究表明中低浓度 IPTG常常更有利于可溶性产物。

诱导时间选择要在表达量与可溶性之间取得平衡；长时间诱导未必带来更多可溶性产品，可能被降解或形成更多聚集物。

部分研究还采用自诱导培养体系（autoinduction），通过合理设计葡萄糖/乳糖/甘油等代谢碳源比，实现表达诱导的自动启动。

4.2 培养基与营养条件

选择高缓冲能力的培养基（如 LB、TB、2×YT）以稳住 pH。

优化氨基酸、维生素、金属离子（如镁、锌、铁等）浓度，有助于蛋白折叠与辅因子结合。

酌情添加辅因子底物或金属离子（针对需金属结合的蛋白），以促进正确折叠。

4.3 折叠助剂 / 添加剂

在诱导阶段或裂解缓冲中添加化学助剂（osmolytes / osmoprotectants / 脂肪醇 / 有机溶剂等）已被证实在不少例子中可以提升蛋白可溶性。

常见添加剂包括：山梨醇 (sorbitol)、甘油 (glycerol)、乙醇 (ethanol)、甜菜碱 (betaine)、丙氨酸 (arginine)、甘氨酸-甜菜碱混合物等。

有研究指出 3 % 乙醇在诱导期加入，可以诱导热休克蛋白表达，从而改善可溶性蛋白产量。此外，还可以在裂解缓冲或纯化缓冲中加入低浓度非离子表面活性剂（如 Tween-20、Triton X-100）或少量还原剂 / 缓冲剂，以稳定可溶性状态。

5. 共表达分子伴侣 / 辅助折叠系统

5.1 内源 / 外源伴侣蛋白共表达

著名的分子伴侣系统包括 DnaK-DnaJ-GrpE、GroEL-GroES、ClpB 等。这些辅助蛋白可以协助新合成链折叠并防止错误折叠、聚集。研究也常将伴侣基因置于另一表达载体或同一载体的下游模块进行共表达。不过要注意共表达伴侣本身可能增加宿主代谢负担，需要在伴侣／目标蛋白比例与表达强度之间调整。

5.2 化学 / 分子折叠调节剂

添加小分子折叠助剂（如低浓度甘油、葡萄糖、谷胱甘肽、氨基酸混合物等）有助于增强折叠路径通量。在文献中，"内在分子重设计 + 外源折叠调节"策略被提出，即既优化蛋白自身，又从环境/辅助角度调控。

6. 裂解、可溶/不溶分离与纯化策略

在裂解缓冲中通常加入适量的缓冲盐 (如 20-50 mM Tris / HEPES)、NaCl、pH 缓冲剂、适量的 PMSF/EDTA/蛋白酶抑制剂等。

裂解方法（超声、酶裂、微流体裂解等）要尽量温和，避免剧烈剪切对蛋白结构造成破坏。

可溶/不溶蛋白分离：高速离心（如 15,000-20,000 × g, 20-30 min, 4 °C），取上清作为可溶部分。

可溶部分进一步纯化（亲和层析、离子交换、凝胶过滤等），并通过 SDS-PAGE / Western blot / 活性测定评估其正确折叠与活性。

三、典型案例分享

案例 1：抗-MICA scFv / MICA / IL-23 p19 的表达优化

背景：三个重组蛋白（anti-MICA scFv、MICA、IL-23p19）原始表达时多为包涵体形式；研究者使用响应面方法 (Box-Behnken 设计) 优化诱导温度、诱导时间、IPTG 浓度三个因素。

主要优化思路：设计 15 个实验组合，测定不同条件下可溶性蛋白产量，从响应面模型中寻找最优点。

结果：不同蛋白的最优条件各不相同（如 anti-MICA scFv 在某组合条件下可获取 ~1.1 mg/mL 的产量）。他们还在逆折叠 / 重折叠阶段进行了快速稀释法 + 不同添加剂组合（NaCl, arginine, glycerol, GSH/GSSG 等）优化，最终获得可结合活性的 scFv。

案例 2：添加剂优化在可溶性蛋白表达中的应用

综述性质研究：文章回顾了近年来在 E. coli 可溶性表达中常用的多种添加剂（诱导剂浓度、osmolytes / osmoprotectants、乙醇、辅因子 / 代谢前体等）对可溶性蛋白产量的影响。

关键发现：

在许多成功报道中，山梨醇 (0.5 M)、NaCl (0.5 M)、甘油 (2 %)、甜菜碱 (betaine) 等具有一定提升效果。

3 % 乙醇有时可诱导热休克蛋白表达，从而改善折叠环境。

对于含辅因子的蛋白（如 FAD、PLP 等酶），在诱导期加入相应辅因子 / 代谢底物（如硫胺素、δ-氨基乙酰丙酸、核黄素等）有助于提高活性形式回收率。

案例 3：新的折叠优化前沿

文献内容：该综述总结了"内在分子重设计"（截断、定向进化、祖先重构、回溯突变）与"外源折叠调控"（伴侣蛋白、化学折叠助剂、融合标签）两大类策略，并提出未来可借助人工智能 + 高通量筛选的折叠优化方向。

亮点：将机械研究与实际策略结合，强调"在机制基础上设计实验路线"，而非仅靠经验堆砌。

可溶性蛋白在原核表达体系中的获得难度通常高于总表达产量，其挑战主要来自于折叠、聚集、宿主压力等多方面因素相互作用。通过系统化设计，从蛋白自身改造、载体与表达调控、宿主菌株选择、表达条件优化、共表达伴侣、折叠助剂配合，到最终纯化验证等多维度入手，才能显著提高成功率。