体内T细胞工程：DNA导向的多价LNP用于靶向T细胞基因递送

脂质纳米颗粒（LNPs）是一种强大的新兴工具，可用于体内T细胞工程，在B细胞淋巴瘤、其他癌症及自身免疫性疾病等领域具有广泛应用。此类疗法的关键挑战在于实现精确的细胞靶向和高效的mRNA翻译。尽管单靶向LNPs已被广泛研究，双特异性LNPs的研究尚处于初步阶段。同时作用于多个T细胞受体有望提升mRNA递送效率、表达水平以及T细胞靶向能力。这里，采用一种DNA锚定方法，实现了利用商品化抗体对LNP的快速修饰。通过该策略，在体外和体内评估了多种双特异性LNPs在T细胞靶向mRNA递送中的表现。发现，相较于单靶向LNPs，某些双特异性配方可显著提高对T细胞的靶向性及转染效率。此外，还发现靶向分子可改变LNPs在脾脏和肝脏中的生物分布。这种快速高效的抗体靶向LNPs组装方法，有助于高通量筛选多种抗体组合，从而提升体内基因递送的特异性和效率。该方法提供了一种模块化策略，可用于识别有效的抗体组合，以增强体内基因递送，且可根据不同难治性疾病进行定制化应用。

LNPs已成为一种强大且可调控的T细胞工程平台，在癌症、T细胞感染和自身免疫性疾病的治疗中展现出巨大潜力。对于B细胞淋巴瘤的治疗，CAR T细胞疗法通过耗时且昂贵的体外T细胞改造过程已表现出显著疗效。目前正逐步转向体内生成CAR T细胞，这一方法可通过现成药物实现，从而简化CAR T细胞的生产流程并提高治疗的可及性。针对B细胞淋巴瘤以及自身免疫性疾病、多发性骨髓瘤、上皮肿瘤和肝癌的体内CAR疗法已进入临床试验阶段。

体内T细胞基因治疗的关键挑战在于开发出能够高效且精准靶向转染T细胞的递送载体。目前，LNP递送技术主要局限于局部给药以及具有天然颗粒摄取倾向的肝细胞。为克服这一限制，研究人员主要采取了两种策略来重定向LNP的生物分布：①优化可电离脂质的结构，以实现对非肝细胞和器官的趋向性；②通过在LNP表面修饰受体特异性抗体，实现靶向递送。后一种方法已尝试针对多种单一T细胞受体靶点，包括CD3、CD4、CD5、CD7和CD8。这些制剂通常转染效率较低，可能归因于T细胞激活不充分或部分激活，而研究表明充分的T细胞激活是LNP递送mRNA表达的关键。在体内，T细胞的激活由其与APCs的相互作用所调控。这种激活是一种多价过程，需要提供一个主要激活信号（通常通过T细胞受体复合物TCR的结合）以及共刺激信号。在体外实验中，通常使用抗CD3与抗CD28抗体的组合来激活T细胞，以模拟APCs提供的刺激。在先前的研究中，采用同时修饰αCD3和αCD28抗体的双特异性LNP用于体外T细胞工程，其转染效率相比仅修饰αCD3的LNP有所提高。某些双特异性制剂，如αCD3/αCD7-LNPs，在体内生成CAR以治疗B细胞白血病方面也取得了成功。进一步在体外和体内对双特异性LNP进行筛选，可能发现新的T细胞表面靶点，从而提升mRNA递送的效率。深入了解共靶向免疫调节信号如何影响T细胞转染，对于优化治疗至关重要，同时也需要建立能够快速组装和筛选多种靶向LNP（tLNPs）组合的方法。

在tLNPs的开发过程中，抗体偶联方面存在若干技术障碍。传统的将抗体偶联到LNP表面的方法，如酰胺键形成和马来酰亚胺化学法，通常耗时较长、效率较低，并可能导致抗体方向错误，不利于大量靶向分子组合的筛选。尽管点击化学可实现多种抗体的快速连接，但缺乏足够的正交偶联化学手段来控制所连接蛋白的比例或空间排列。相比之下，寡核苷酸组装已被证明是一种稳健、快速且精确的将抗体连接至纳米颗粒的方法。通过利用互补核酸序列之间高度特异性的碱基配对相互作用，研究人员能够设计并调控特定材料与生物分子之间的相互作用。

在此，开发了一种利用商业抗体通过DNA锚定快速修饰LNPs的工作流程，用于筛选抗体组合以提高T细胞的转染效率。选择T细胞作为模型，因其具有治疗相关性、难转染特性以及不同亚群表面标志物表达明确的特点。展示了双特异性LNPs在体外向Jurkat细胞和原代T细胞递送以及在体内筛选高效配方的应用。通过利用这种DNA锚定方法将抗体连接至LNPs，能够快速鉴定出可有效靶向并转染T细胞的抗体组合，为多种疾病中高效的体内T细胞工程化奠定了基础。

DNA连接实现与LNP表面的快速高效结合

采用DNA拴系偶联方法将抗体连接到LNP表面（图1A）。首先，使用可电离阳离子脂质Dlin-MC3-DMA制备LNP，该脂质也曾用于首个获得FDA批准的LNP基因疗法。通过无铜点击化学法合成了寡核苷酸偶联脂质（DNA-脂质），并利用质谱法确认其结构。使用光激活的Protein G将单链DNA的互补链连接至目标抗体（DNA-Ab），该方法可高效实现几乎所有IgG抗体的位点特异性修饰（AlphaThera）。通过凝胶电泳验证了DNA-Ab的成功合成。将DNA-脂质插入预先形成的LNP中，并使用荧光标记的互补DNA（cDNA）结合尺寸排阻色谱法（SEC）评估插入效果（图1B-D）。比较了含有15个原子的四乙二醇（TEG）间隔基的DNA-脂质链与不含间隔基的DNA-脂质链的使用效果（表S1）。结果发现，使用不含TEG间隔基的DNA-脂质时，偶联的cDNA平均量增加了两倍以上（图1B）。这种偶联效率的差异表明，TEG间隔基可能阻碍了脂质的后插入过程，或在空间上阻碍了cDNA链的结合。因此，后续所有研究均未使用TEG间隔基。

表S1 用于抗体固定的DNA序列。测试了含和不含间隔序列的DNA序列对LNPs的抗体连接效果。

接下来，希望评估在生理相关浓度的DNase存在下，DNA连接臂的稳定性。若该修饰方法在体内具有实用性，则其连接策略必须保持稳定。实验采用0.5 U/mL的DNase I浓度，略高于研究报道的人血浆中平均DNase活性（0.356±0.410 U/mL）。为验证DNase I的活性，使用10,000 U/mL的高浓度作为阳性对照以确认酶活性。结果发现，在0.5 U/mL浓度下，cDNA链仍保持与颗粒表面的连接；而在10,000 U/mL的高浓度DNase条件下，通过SEC分析显示cDNA几乎被完全切割（图1C）。

随后，量化了DNA-Ab与颗粒表面的结合情况。使用5 µM的DNA-脂质和0.06 µM的荧光AF647 CD28 DNA-Ab对LNPs进行修饰。30min后，将这些合成的颗粒通过SEC分析，发现每毫摩尔LNP脂质所结合的抗体平均为10.7±1.3纳摩尔（图1D）。在加入0.5 U/mL DNase I孵育30min后，该数值未发生显著变化，表明这些颗粒在体内可能具有稳定性。利用NanoSight300（Malvern）对包含mCherry或Fluc mRNA的4批LNPs进行检测，结果显示颗粒浓度为6.33×10¹¹ ± 1.2×10¹¹ 粒子/mL。结合SEC测得的抗体浓度与上述颗粒浓度估算，每个LNP上大约结合有33±3个抗体，约为理论上加入溶液中抗体最大量的58%。

合成LNPs的尺寸和包封效率也进行了表征，以确认LNP的形成。通过DLS测定，mCherry LNPs的粒径为128.3±1.1 nm，PDI为0.27（图1E）。DNA-脂质修饰LNP和tLNP的直径分别增加至约141.3±2.3 nm和140.6±1.9 nm，PDI保持一致（图1F）。通过CryoEM进一步确认了LNP的大致尺寸和球形结构。使用Quant-it RiboGreen RNA检测试剂盒测得mCherry LNPs的包封效率为80.2%。

图1 抗体通过DNA连接至LNP的方法及颗粒表征。

DNA介导的抗体与LNPs的偶联可提高Jurkat细胞的转染效率

为初步评估LNP在体外的转染效果，使用单靶向和双特异性LNP对Jurkat细胞进行转染。所有Jurkat细胞实验均采用包裹编码荧光素酶mRNA的LNP。测试了五种偶联αCD3的LNP变体在不同mRNA剂量下对Jurkat细胞的转染水平和细胞活力，以验证偶联策略的功能性（图2A）。文献中已充分证实αCD3-tLNP的有效性，因此该靶向分子被用作初始验证研究的模型，并在后续所有实验中作为对照。总体而言，Fluc表达随LNP剂量增加而上升（图2B）。值得注意的是，与未经修饰的LNP相比，颗粒表面添加DNA、偶联同型非结合抗体以及未偶联LNP但溶液中加入可溶性αCD3均能提高转染效率。然而，当使用αCD3-LNP转染细胞时，荧光素酶表达最高。此条件下细胞活力最低（图2C）。为避免过高细胞毒性，后续所有Jurkat细胞实验均采用750 ng/100,000细胞的mRNA剂量。

接下来，筛选了靶向各个常见T细胞表面受体的抗体，以评估其增强LNP介导的Jurkat细胞转染的能力。每种制剂均在有无DNA-脂质的情况下进行测试，以确认偶联策略对实现高效转染的必要性。在所有情况下，仅在LNP上存在DNA-脂质即可改善Jurkat细胞的转染效果（图2D）。其中，αTCR、αCD3、αCD5和αCD28-LNPs显示出最高的T细胞转染效率。值得注意的是，αTCR和αCD3结合的是T细胞受体复合物中的蛋白，而αCD28是一种常用的共刺激分子。所有被筛选抗体对应的Jurkat细胞活力均保持在约75%左右，其中αTCR和αCD3-LNPs组的细胞活力最低（图2E）。

接下来，确定这些抗体的联合使用是否能够提高Jurkat细胞的转染效率。通过以1:1比例组合两种抗体，在LNPs表面筛选了36种不同的抗体组合。结果发现，包含αTCR或αCD3的组合在将荧光素酶转染入Jurkat细胞方面比其他组合更有效。值得注意的是，αTCR/αCD2、αCD3/αCD2、αCD3/αTCR和αCD3/αCD28-LNP在所筛选的36种组合中表现出最高的荧光素酶表达水平（图2F）。在后续研究中，由于它们在Jurkat细胞中具有较高的转染效率，因此选择了αCD3/αTCR、αCD3/αCD2和αCD3/αCD28-LNPs用于外周血原代细胞的筛选。此外，选择αCD3/αCD4-LNPs是因为其可能选择性靶向CD4+ T细胞，而这类细胞与CAR T细胞及自身免疫细胞治疗相关；同时选择αCD3/αCD5-LNPs，是因为αCD5结合有可能调节T细胞功能。

图2 mRNA剂量反应曲线及单特异性和双特异性DNA锚定tLNP的测试。

双特异性LNP通过抗体结构域特异性结合T细胞上的相应受体，增强在人混合血细胞群体中对T细胞的转染

接下来，评估了双特异性LNPs在人混合血细胞群体中特异性转染T细胞的能力。将修饰有αCD3/αTCR、αCD3/αCD2、αCD3/αCD4、αCD3/αCD5和αCD3/αCD28的LNPs与未修饰的LNPs及单特异性αCD3-LNPs进行了比较。每组LNPs均包封编码mCherry的mRNA。PBMCs以2000ng mRNA/100,000个细胞的剂量与LNPs孵育24小时。通过流式细胞术，检测了T细胞（CD3+、CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞）、CD19+B细胞以及CD14+单核细胞中mCherry的表达情况。在包含CD4+和CD8+亚型的CD3+细胞中，使用单特异性αCD3-LNPs处理后，约2.9%的CD4+细胞被转染；而加入含有αCD3与其他抗体（αTCR、αCD2、αCD4、αCD5和αCD28）组合的双特异性LNPs后，除αCD3/αCD4-LNPs外，其余均显著提高了转染效率（图3A）。在分析CD4+辅助性T细胞时，发现修饰有αCD3/αCD4的双特异性LNP实现了最高的转染效率，约为8%，高于缺乏αCD4靶向配体的纳米颗粒。CD8+细胞在与不同类型LNPs孵育后，转染效率无显著差异，且整体转染效率低于CD3+和CD4+细胞类型（图3B）。该结果表明，CD3+细胞中观察到的转染效率提升主要源于存在针对CD4+的靶向分子以及共刺激结合分子，其中包括CD2+和CD28+。

与受体介导的转染一致，当T细胞与靶向这些分子的LNPs共同孵育时，观察到CD3+受体的下调（图3D）。在PBS或未经修饰的LNPs处理的对照组中，约65%的细胞为CD3+，而在经修饰的LNPs处理后，CD3+表达下降至所有细胞的约3%（图3D）。所观察到的下调表明tLNPs与目标细胞表面受体之间发生了特异性的抗体-受体相互作用，证明了分子层面的精确结合是转染效率提高的基础。

接下来评估了其他细胞类型对纳米颗粒的非靶向摄取情况，这是靶向递送系统设计中的一个关注点。检测了CD19+ B细胞和CD14+单核细胞，以分析tLNPs可能引起的非靶向转染。所有LNPs在CD19+细胞中均表现出较低的mCherry表达，但使用αCD3/αCD5-LNPs时，B细胞的mCherry表达最高，约有1.5%的B细胞被转染（图3E）。这可能是由于人B细胞表面存在低水平表达的CD5清道夫受体，该受体常用于区分B1和B2细胞亚群。与非靶向LNPs相比，使用tLNPs后单核细胞的平均转染效率显著下降，在所有抗体偶联的LNP组中，转染率从约57%降至20%（图3F）。尽管tLNPs在单核细胞中仍表现出约20%的中等转染效率，相较于T细胞而言仍然偏高，但这一下降趋势显示出更高的选择性。由于单核细胞和巨噬细胞是纳米颗粒非特异性清除的主要贡献者，当目标是将mRNA递送至T细胞等特定细胞类型时，这些细胞的高摄取通常并不理想。研究结果表明，在LNPs表面引入T细胞特异性靶向配体不仅增强了对目标细胞群体的转染效率，同时也减少了非靶向免疫细胞的非特异性摄取，从而提高了载mRNA纳米颗粒的递送特异性。

图3 双特异性LNPs可在体外增强人混合血细胞群中初级T细胞的转染。

抗体偶联的LNPs促进脾脏中器官特异性的转染

最后，在体内评估了双特异性LNPs。在本研究中，使用了在体外对T细胞转染效率最高的tLNPS：与αCD3/TCR、αCD3/αCD2以及αCD3/αCD4-LNPs偶联的颗粒，并将其与对照组进行比较，对照组包括PBS、未修饰的LNPs、同型对照（iso-LNPs）以及单抗体αCD3-LNPs。所有LNPs均包含编码Fluc的mRNA，每组LNPs以0.6 mg/kg体重的剂量给予小鼠。在给药后0.5h、5h和24h，利用活体成像系统（IVIS）获取图像，以监测随时间变化的发光表达，反映mRNA的功能性递送情况；并在24h时采集器官并单独成像（图4A）。

首先评估了tLNPs在器官中的特异性转染情况，重点关注肝脏和脾脏，同时也检测了其他器官。脾脏和肝脏的发光成像显示，tLNPs的生物分布随其表面靶向性的不同而存在差异（图4B）。在选定一致的兴趣区域并进行背景归一化后，计算得到通量，结果显示αCD3/αTCR-LNPs在肝脏和脾脏中的转染效率最高（图4C）。与非靶向LNP相比，tLNPs使转染从肝脏更多地转向脾脏。其中，注射αCD3-LNPs后脾脏与肝脏的发光比值最高。而靶向αCD3/TCR和αCD3/αCD2-LNP的比值有所下降，因为尽管脾脏发光较强，但肝脏的发光显著更高（图4D）。αCD3/αCD4-LNP在所有tLNP组中脾脏发光最低，可能是因为其仅靶向T细胞的一个亚群而非全部T细胞。相比之下，非靶向LNP主要转染肝脏，导致所有制剂中最低的脾:肝发光比值（图4E）。这一结果与先前研究一致，即Dlin-MC3-DMA LNP倾向于在肝脏中富集。

在24h时，分析了脾脏的物理特征，包括T细胞的空间分布和物理性增大，因为脾脏白髓是T细胞活化和增殖的主要部位。脾脏组织切片采用H&E染色，并标记CD4和CD8（图4F）。H&E染色显示，与对照组相比，αCD3-LNP组和双特异性LNP组的白髓区域（深紫色）明显扩大（图4F）。所有组别的CD4+和CD8+细胞似乎仍主要集中于动脉周围淋巴鞘（PALS），但与对照组相比，αCD3-LNP组和双特异性LNP组中这些细胞群体显著增多，表明这些细胞接触到了T细胞特异性抗体，从而导致脾脏内T细胞生成增加（图4F）。T细胞增殖通常发生在T细胞活化之后，提示tLNP引发了免疫反应。而Iso-LNP处理组未观察到此类增殖现象，说明该增殖效应源于T细胞特异性配体，而非LNP载体、mRNA、DNA锚定物或抗体整体结构所致。除了脾脏T细胞在形态学上的增加外，与未经修饰的LNP组相比，加入T细胞特异性抗体后脾脏总体质量也有所上升，表明脾脏增大与αCD3及双特异性表面修饰相关（图4F）。总体而言，这表明抗体表面修饰可影响LNP的靶向性，但也需考虑其他因素，如LNP的脂质组成。

图4 tLNPs促进脾脏的转染。

选择性双特异性LNP配方可增强T细胞转染并减少体内CD3耗竭

接下来，评估了tLNPs在体内的细胞特异性转染效果。分析了静脉注射后6h血液、脾脏和淋巴结中存在的T细胞（CD3+、CD4+ 和 CD8+）、B细胞（CD19+）以及单核细胞（CD11b+）的情况（图5A）。LNP制剂被组装成包裹编码mCherry的mRNA，并通过流式细胞术分析上述区域中mCherry+细胞的百分比。在血液中，发现所有双特异性LNP制剂相较于αCD3 LNP及所有LNP对照组均提高了总T细胞（CD3+）的转染效率。其中，αCD3/αTCR-LNP在血液中对CD4+和CD8+ T细胞的联合转染表现出最高的mCherry+细胞比例，转染效率约为10%，明显高于单特异性αCD3 LNP（3%转染）和LNP对照组（转染率低于2%）。双特异性LNP对T细胞转染效率的提升可能是由于这些LNP能够同时结合T细胞受体复合物上的两个不同表位，从而增强受体介导的内吞作用（图5B）。在血液中的单核细胞中，也观察到双特异性LNP相较于单特异性αCD3 LNP和对照LNP同样提高了转染效率。推测这种单核细胞转染增强可能源于双特异性LNP表面存在额外的Fc区域，从而增强了与单核细胞上清道夫受体的相互作用。为减少此类摄取，建议在后续tLNP制剂中使用抗体片段（如纳米抗体或单链可变片段），而非全长IgG。在脾脏中，经DNA修饰的LNP相比未修饰LNP实现了更高的转染效率，表明该修饰化学具有一定促进脾脏T细胞转染的能力（图5D）。各组脾脏中单核细胞的转染水平仍保持较低（图5E）。总体而言，T细胞转染效率提升至最高达10%的水平，与CAR T等体内基因递送疗法所需水平一致，也进一步支持了利用DNA锚定策略构建具有治疗潜力的tLNP的可行性。

在血液中，正如先前在体外PBMCs中观察到的那样，所有tLNP组均出现了CD3+细胞的减少（图5F）。CD3表面标志物的减少与TCR复合物的内化相关，而该复合物的表达对于T细胞的正常激活及产生功能性免疫应答至关重要。其中，αCD3-tLNPs和αCD3/αTCR-tLNPs导致血液中CD3+细胞减少最为显著。然而，与αCD3-tLNPs相比，αCD3/αCD2和αCD3/αCD4-tLNPs对T细胞受体复合物的减少程度较低，同时仍能提高血液中T细胞的转染效率。在脾脏中也观察到αCD3-tLNPs引起类似的CD3减少趋势（图5G）。这些结果表明，tLNP所选用的抗体不仅影响转染后TCR的表达水平，还可能影响下游的TCR信号传导及功能激活。

图5 选择性LNP制剂可增强T细胞转染并减少耗竭。

总结

通过将全长商业抗体与Dlin-MC3-DMA LNP以DNA链连接的方式偶联，证明了tLNP可通过特异性抗体-受体相互作用提高体内T细胞转染效率。具体而言，发现双特异性LNP在体外PBMC实验以及体内血液环境中，相较于单抗体配方均显著增强了T细胞的转染效果，表明通过共靶向受体可提升细胞选择性mRNA递送效率。

这里强调了以TCR复合物为靶点作为提高T细胞转染效率的策略性意义。TCR复合物在静息状态的T细胞中通常稳定表达并快速循环。该受体的内吞作用使得治疗性纳米颗粒（如tLNP）可通过结合TCR复合物受体进入T细胞，从而克服T细胞对颗粒摄取的天然抵抗。包含靶向TCR或CD3抗体的双特异性LNP比不靶向T细胞受体的LNP具有更强的转染能力。其中，双特异性αCD3/αTCR-tLNP在循环T细胞中实现了最高的转染率（约10%）（图5A），并在脾脏中达到最高的转染水平（图4C）。这表明靶向同一受体复合物上的两个表位可产生协同效应，并可能影响纳米颗粒在体内的分布。然而，这种方法也可能存在缺陷，例如当仅通过TCR复合物激活T细胞而缺乏共刺激信号时，观察到CD3+耗竭增加。在这种情况下，低CD3+表达的T细胞可能变得功能失活，尽管有报道显示，在系统循环中αCD3完全清除后，T细胞恢复CD3+表达的能力。虽然超出当前项目的范围，但仍需进一步研究CD3耗竭如何影响后续T细胞的功能性激活。为了在维持TCR复合物靶向所带来的高效转染和细胞特异性递送的同时避免CD3+耗竭，包含共刺激配体的双特异性LNP可能为体内基因递送提供更有效的治疗策略。

研究中，包含共刺激分子（如αCD3/αCD2-LNPs和αCD3/αCD4-LNPs）的双特异性tLNPs相较于仅含αCD3的tLNPs，在血液中的转染效率更高。它们还提高了特定T细胞亚群（此处为CD4+辅助性T细胞）的转染效率。值得注意的是，与单独使用αCD3相比，这些双特异性组中CD3的表达有所增加，从而减轻了受体过度耗竭的问题。在先前的研究中，设计用于同时结合CD3和共刺激受体的双特异性tLNPs（例如CD3/CD28和CD3/CD7）相较于单靶向版本表现出更强的活性，这一趋势在该结果中也得到了印证。共刺激分子的选择似乎同时影响了细胞特异性的mRNA递送效率以及细胞的活化能力。

对循环T细胞的转染对于体内细胞工程和免疫调节至关重要，实现的约10%循环T细胞转染率处于实现体内CAR-T生成和免疫调节治疗效果所需的理想范围内。更重要的是，DNA锚定方法简化了偶联过程，避免了传统化学方法的局限性，从而实现了新型双特异性或多价制剂的快速、高通量体内筛选。预计，利用该方法组装多价tLNP和纳米颗粒的便捷性将有助于快速筛选出针对特定疾病和靶细胞的纳米颗粒靶向配体。此外，该方法的模块化特性使得靶向分子、多种抗体的化学计量比以及锚定链长度的更换与精确调控更加简便。这种对tLNP的理化控制有助于探索多种受体组合，以优化未来抗体-LNP疗法的特异性、疗效和生物分布。

P. R. Desai, J. F. Marko, Molecular crowding suppresses mechanical stress-driven DNA strand separation. Biophysical Journal 124, 1886-1890 (2025).

B. Jaime Fernández et al., T cell-specific non-viral DNA delivery and in vivo CAR-T generation using targeted lipid nanoparticles. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 13, e011759 (2025).

X. Huang et al., DNA scaffolds enable efficient and tunable functionalization of biomaterials for immune cell modulation. Nature Nanotechnology 16, 214-223 (2021).

E. S. José, A. Borroto, F. Niedergang, A. Alcover, B. Alarcón, Triggering the TCR Complex A. E. Metzloff et al., Antigen Presenting Cell Mimetic Lipid Nanoparticles for Rapid mRNA CAR T Cell Cancer Immunotherapy. Advanced Materials 36, 2313226 (2024).

Mary D. Kelly et al., DNA-Directed Assembly of Multivalent Lipid Nanoparticles for Targeted T Cell Gene Delivery. BioRxiv. 09.04.674323. (2025)