筛选MM和AML患者中的肿瘤反应性T细胞——单细胞光流控系统

在血液系统恶性肿瘤中，由于肿瘤反应性T细胞的稀有性以及骨髓微环境的复杂性，其检测和特征鉴定受到限制。为了识别此类克隆型并定义它们在体内的表型和功能状态，对总共27名新诊断的多发性骨髓瘤（NDMM，n=20）和急性髓系白血病（AML，n=7）患者的骨髓淋巴细胞（BMLs）进行了整合分析。在初次诊断时获取了骨髓抽吸物，并对其进行了并行的单细胞转录组、蛋白质组、TCR以及功能分析（图1a）。

图1a 多平台整合发现MM和AML患者骨髓中肿瘤反应性T细胞及抗原。多发性骨髓瘤（MM）和急性髓系白血病（AML）中肿瘤反应性骨髓淋巴细胞（BMLs）鉴定流程的示意图。步骤包括：①在微流控腔室中与自体肿瘤细胞进行功能性共培养实验；②5′单细胞RNA和TCR测序；③通过全基因组测序（WGS）、RNA-seq和HLA I类免疫肽组学发现肿瘤抗原；④基于免疫肽组学的MANAFEST（突变相关新抗原特异性T细胞功能扩增）和ViraFEST实验；⑤将TCR表型映射至单细胞转录组数据，并构建肿瘤反应性BMLs保守的转录特征；⑥在独立患者队列和治疗背景下进行临床关联分析。

为建立BML表型及其TCR克隆型的高分辨率图谱，采用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）与单细胞V(D)J测序（scVDJ-seq）相结合的方法，从而能够同时评估基因表达和成对的TCR身份信息（图S1）。在患者队列中获得了187,015个高质量转录组，代表了132,501个独特的TCR克隆型（图S2a-d）。对BML进行无监督聚类分析揭示出13个表型亚群，包括主要的CD8⁺效应记忆（CD8_EM）、前体耗竭（CD8_PEX）和干细胞样记忆（CD8_SM）T细胞群体，以及初始和记忆型CD4⁺亚群和调节性T细胞，这与既往在未经治疗的MM和AML中的研究结果一致（图S1c-d，图S2a-b）。次要群体包括NK样和静息T细胞。

图S1多发性骨髓瘤初诊患者骨髓淋巴细胞的单细胞分析。

图S2 新诊断多发性骨髓瘤（NDMM）与急性髓系白血病（AML）中BML TCR的比较分析。

为了将表型与克隆型关联起来，在初诊时分析了132,501个TCR克隆型。扩增的克隆富集于CD8_EM和CD8_PEX表型的细胞中，符合抗原驱动选择的特征（图S2c-f）。相比之下，克隆多样性高且未扩增的T细胞主要存在于初始和记忆性CD4⁺区室中（图S2g），这表明克隆扩增本身与BMLs的状态和谱系相关，但可能不足以作为肿瘤反应性的充分指标。

为了在两种疾病中鉴定出具有功能性的肿瘤反应性T细胞，采用了双重筛选策略：(1）正向筛选，将单个BML暴露于微流控腔室中患者自体的MM/AML细胞；(2）反向抗原指导筛选，基于全基因组测序/RNA测序预测及免疫肽组学定义的肿瘤抗原，应用一种常用的功能性扩增检测方法（MANAFEST/ViraFEST）来检测抗原响应性T细胞（图1a）。

在正向筛选中，将单个BML与自体原发肿瘤细胞共培养16小时。微流控检测同时捕获了T细胞与肿瘤细胞接触后分泌的细胞因子（IL-2、IFN-γ、TNF）以及表面CD137（4-1BB）的上调情况（图1b）。结合通过同步进行的scTCR-seq在患者活检样本中观察到的独特BML克隆型中位数及其分布，并参考本筛查方法的基准参数，单个TCR以≥95%概率至少被检测到一次的最低频率约为0.2%（即每个克隆含42个细胞）。在总共42,262个接受功能性筛选的BML中，鉴定出673个BML（约占每名患者1.21%）表现出至少一种肿瘤反应性信号，这些细胞被回收并进行了配对的TCRA/B测序（图1b-c）。IFN-γ是最常分泌的细胞因子，其次为TNF和IL-2。一部分T细胞表现出多功能性，可同时分泌多种细胞因子并表达CD137（图1c）。几乎所有患者的样本中均检测到对肿瘤有反应性的BML，但其丰度和功能特征在不同个体及疾病类型间存在差异（图1d-e）。多发性骨髓瘤（MM）样本中肿瘤反应性细胞的整体频率高于急性髓系白血病（AML），尤其是在共表达CD137的CD8⁺多功能T细胞中更为显著（图1f-g）。仅分泌IL-2的细胞均为CD4⁺，成功回收并鉴定了具有前体耗竭表型的CD4⁺和CD8⁺ TCR（图1g，图S3a）。利用CDR3序列作为独特的克隆条形码，将这些功能上鉴定出的TCR映射至scRNA/V(D)J-seq数据集，发现肿瘤反应性克隆的丰度与典型的转录程序相关。扩增程度较低的肿瘤反应性T细胞表达如SELL和IL7R等淋巴祖细胞标志物，而高度扩增的反应性克隆则表达包括GZMB、GNLY、PRF1和NKG7在内的细胞毒性NK样效应基因（图S3b）。

微流控筛选方法：肿瘤反应性T细胞的抗原非依赖性筛选

1）BMLs的分离后。使用死细胞去除试剂盒去除死细胞。使用T细胞分离试剂盒分离未接触的T细胞。

2）患者自体CD138+浆细胞或白血病细胞分别使用CD138或CD33 MicroBeads从解冻的骨髓单个核细胞中分离获得。

3）肿瘤反应性T细胞在Lightning™光流控系统（Bruker）上的单细胞相互作用实验中被鉴定。使用BLI清洗液（PhenomeX）和ddH2O对Lightning系统进行了完整的清洗流程。使用润湿液（Bruker）润湿OptoSelect™芯片。将人IFNγ、IL-2和TNFα捕获微珠通过光电定位技术加载至OptoSelect™芯片的NanoPen™腔室中。随后，将单个T细胞和患者匹配的肿瘤细胞分别转移至OptoSelect™芯片的各个NanoPen™中。

4）作为阴性对照，OptoSelect™芯片的12个视野（FOVs）之一仅加载T细胞和细胞因子捕获微珠。

5）作为阳性对照，另一个视野加载T细胞和人T激活微珠。

6）细胞在OptoSelect™芯片上以细胞培养基于36°C、5% CO2条件下共培养12小时。

7）随后，向OptoSelect™芯片灌注检测抗体混合液（72µl LEGENDplex human Th panel检测抗体，4µl Brilliant Violet 421-anti-hCD137抗体，以及4µl FITC anti-human CD8抗体），持续30分钟。

8）用细胞培养基清洗细胞和细胞因子捕获微珠45分钟。

9）接着，向OptoSelect™芯片灌注链霉亲和素-PE溶液（8µl LEGENDplex Streptavidin-PE溶于72µl PBS中），持续30分钟。

10）再次用细胞培养基清洗细胞和细胞因子捕获微珠45分钟。

11）以10倍放大倍数采集细胞和细胞因子捕获微珠的荧光与明场图像（DAPI、FITC、CY5、PE、OEP滤光片）。使用Image Analyzer软件（Bruker）分析荧光图像。

方法：肿瘤反应性T细胞的分离与TCR测序

1）通过OEP™技术，将反应性T细胞从OptoSelect™芯片各自的NanoPens™中释放，并导出至96孔PCR板中含10µl TCL（2X）缓冲液的孔内。

2）每个T细胞导出样本上方覆盖30µl矿物油，在室温下以1000g离心5min。

3）使用20µl RNAClean XP磁珠提取RNA。磁珠用80%乙醇清洗两次，在室温下干燥2min后，重悬于4µl冰上预冷的逆转录混合液1（每孔：1.0µl TCRseq引物1、1.0µl dNTP混合液、0.2µl RNase抑制剂、1.8µl ddH2O）。

4）导出板在72°C孵育3min，随后逐步冷却至4°C。向导出板的每孔中加入3µl冰上预冷的逆转录混合液2（每孔：0.5µl TCRseq引物2、1.3µl RT缓冲液、1.0µl RT添加剂、0.1µl RNase抑制剂、0.1µl RT酶）。

5）使用热循环仪（42°C 50min，10个循环：50°C 2min、42°C 2min，随后85°C 5min）合成第一链cDNA，并用20µl MagBind Total Pure NGS磁珠进行纯化。磁珠用50µl 80%乙醇洗涤两次，在室温下干燥2min，然后加入30µl无核酸酶水洗脱cDNA。

6）通过琼脂糖凝胶电泳和DNA定量检测每个输出T细胞中TCR的回收情况。在冰上准备新的PCR板（每孔：5.0µl PCR酶K，0.4µl TCR扩增引物混合物，3.6µl ddH2O，1.0µl纯化的cDNA），使用热循环仪扩增TCR α和β链的V(D)J区域（96°C 3min，23个循环：98°C 20s、70°C 30s、72°C 20s，随后72°C 5min）。

7）在新的96孔板中于冰上配制包含每种TCR扩增子特异性index对的反应体系（每孔：5.0µl PCR酶K，0.5µl TCR Index（N7XX和S5XX，Illumina），4.0µl ddH2O，0.5µl扩增后的TCR产物）。通过加标签PCR为不同TCR扩增子添加条形码（96°C 3min，10个循环：98°C 20s、70°C 30s、72°C 20s，随后72°C 5min）。

8）取每种PCR反应产物各2µl混合，使用0.8倍体积的MagBind Total Pure NGS磁珠纯化带index的文库。DNA用80%乙醇洗涤两次，磁珠室温干燥3分钟，随后从磁珠上洗脱带index的文库。将带index的TCR扩增子多重样本以10nM浓度在Illumina MiSeq系统上进行测序（双端300 bp）。

9）使用MiXCR识别TCR V(D)J和CDR3序列。筛选出读段数超过100且具有功能性CDR3区域（无终止密码子、框内连接）的TCR序列用于分析。对于全长TCRα和TCRβ序列中未覆盖的区域，通过与IMGT/V-QUEST比对后选取序列同源性最高的已发表TCR序列进行重建。

图1b-c 多平台整合发现MM和AML患者骨髓中肿瘤反应性T细胞及抗原。b，功能筛选实验的代表性图像。单个BML在含有细胞因子捕获珠的纳米孔腔中与自体肿瘤细胞（MM / AML）共培养16小时，检测4-1BB、IFN-γ、IL-2和TNF的表达。回收肿瘤反应性细胞并进行TCRA/B测序。c，Venn图总结了673个肿瘤反应性TCR的特征。多功能性定义为同时表达4-1BB和≥1种细胞因子。

图1d-e 多平台整合发现MM和AML患者骨髓中肿瘤反应性T细胞及抗原。d-e，25个MM（d）和9个AML（e）检测运行中肿瘤反应性事件的分布。

图1f-h 多平台整合发现MM和AML患者骨髓中肿瘤反应性T细胞及抗原。f，每个样本中肿瘤反应性BMLs的累积频率。采用非配对双尾t检验对MM和AML进行统计学比较。g，根据CD4⁺或CD8⁺ T细胞亚群分层的肿瘤反应性BMLs比例。采用非配对双尾t检验对MM和AML进行统计学比较。h，热图总结了19个代表性重建的BML来源TCR的肿瘤特异性检测结果，每个TCR均针对自体肿瘤细胞（肿瘤）、健康外周血单个核细胞（自身）和病毒肽池（病毒）进行测试。数据表示每个TCR在n=3次实验重复中的平均4-1BB MFI值。

为验证回收的TCR对肿瘤的特异性，通过基于mRNA的方法在患者自体外周血T细胞中重建了选定的克隆型（图S3c-g）。随后进行的正交共培养实验利用CD69的上调情况，验证了每位患者中TCR对自体肿瘤细胞呈HLA依赖性的反应，而对自体健康PBMC或病毒肽段无反应，尽管部分TCR表现出交叉反应性（图1h，图S4，图S5，图S6a-c）。综上所述，这些功能筛选数据表明，在MM和AML患者的BML中普遍存在对肿瘤有反应性的TCR。

图S3 肿瘤反应性TCR克隆型的转录及功能特征。a. 通过整合的单细胞RNA测序和V(D)J数据，将功能验证的TCR克隆型匹配至CD4⁺或CD8⁺ T细胞后的转录簇分布。b. 热图显示在大的（>1%细胞）和小的（<1%）肿瘤反应性及非反应性TCR克隆型中，前20个标志基因的平均表达水平。c. 用于体外转录患者来源TCRA/B V(D)J区域并融合小鼠TRAC或TRBC恒定区的线性DNA构建体示意图，以实现流式细胞术检测。d. 通过表面检测小鼠TRBC（mTRBC）来鉴定电穿孔转入的转基因TCR表达T细胞的设门策略。e. 转基因T细胞中mTRBC表达的代表性流式细胞术图。f, g. 电穿孔后TCR表面表达的动力学，包括时间过程（f）和mRNA剂量滴定（g）。

图S4 患者自体肿瘤反应性TCR的功能检测。a. 使用自体T细胞和肿瘤细胞进行TCR验证的工作流程示意图。b. 检测转基因TCR（mTRBC）表达及CD69作为早期活化标志物的设门策略。c. 在与自体肿瘤细胞或对照共培养条件下，经功能验证的肿瘤反应性TCR（上）、孤儿（非反应性）TCR（中）以及病毒反应性TCR（下）的代表性CD69表达情况。d. 三次独立实验（电穿孔+共培养）中CD69上调的定量分析。

图S5 肿瘤反应性TCR激活的MHC依赖性。a. 实验示意图，显示在存在抗HLA-ABC阻断抗体或同型对照的情况下，TCR转染的T细胞与自体肿瘤细胞的共培养。b. 在指定条件下，TCR转染T细胞的代表性流式细胞术图谱。c. 14种肿瘤反应性TCR中CD69上调的定量分析。使用一种孤儿TCR作为阴性对照。

图S6 肿瘤反应性和交叉反应性TCR的特异性分析。a, b，将转染了TCR的自体T细胞与自体肿瘤细胞、外周血单个核细胞（健康对照）、CEFT肽混合物（病毒对照）或无抗原共同培养，16小时后检测CD69表达水平。数据展示的是（a）肿瘤反应性及（b）交叉反应性TCR的结果，每种条件均进行三次重复实验。

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