文献速递 | 三代测序无家系PGT-M方案的临床应用新成果

2025年8月20日，Scientific reports期刊在线发表题为"Clinical application of nanopore sequencing for haplotype linkage analysis in preimplantation genetic testing for Duchenne muscular dystrophy "的研究成果。本研究首次证实了纳米孔测序技术在无家系DMD 疾病 PGT-M 中的应用可行性。为解决家系不全、新发突变的DMD 疾病 PGT-M 提供了切实可行的方案。

01 研究背景

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种X连锁隐性遗传病，活产男婴发病率约1/5 000。患儿通常3-5岁起发病，12岁丧失行走能力，20-40岁多因心肺衰竭夭折。该疾病是由人类基因组中已知最大的基因DMD突变引起。该基因位于Xp21区域，包含 79 个外显子。在 DMD 患者中已发现多种突变类型：其中缺失突变约占病例总数的 60%-70%，重复突变约占 5%-15%，而点突变或其他小型重排突变则占剩余的 20%。胚胎植入前单基因病检测（PGT-M）已被广泛应用，用于帮助携带单基因突变的夫妇生育健康后代。传统PGT-M采用二代测序平台，需要借助完整家系构建致病染色体SNP单体型，进而对胚胎进行连锁分析诊断。但对于新发突变、家系不完整单基因疾病，传统基于NGS平台的PGT-M无法提供有效的检测方案。

本研究旨在评估纳米孔测序技术应用于 DMD 的 PGT-M 可行性。选择2个完整家系DMD案例，同时进行常规二代测序方案PGT-M及牛津纳米孔测序方案的PGT-M。利用二代测序方法结果对纳米孔测序结果的准确性进行验证，随后又通过羊膜穿刺术进一步确认。

02 研究结果

基于二代测序DMD突变检测结果

家系 1为DMD基因的 15-17 号外显子重复突变，家系验证显示突变遗传自母亲（图1A和1B）。家系 2为 DMD 基因3-9 号外显子缺失突变，家系验证结果显示先证者及其母亲均存在（图1C和1D）。

图1 家系中DMD突变携带情况

家系1共获得5枚囊胚（编号 E1-5），囊胚活检后CNV检测结果显示，囊胚 E3、E4 和 E5 为整倍体胚胎（见表1）。家系2共检测了 12 枚囊胚，5枚囊胚（E2、E5、E8、E10 和 E12）为整倍体胚胎（见表2）。家系1中，基于二代测序数据在DMD基因上下游1Mb范围内进行胚胎SNP单倍型连锁分析。结果显示，囊胚 E2、E4 和 E5 携带 15-17 号外显子的杂合重复突变，而囊胚 E1 和 E3 未遗传母亲的 DMD 基因突变（见图 2A；表 1）。

家系 2 采用相同的方法进行胚胎SNP 单倍型连锁分析。结果显示，5 枚囊胚（E3、E4、E5、E6 和 E12）未遗传母亲的 DMD 基因突变（见图 2B；表 2）。

表1 家系1胚胎整倍体及突变连锁分析结果

表2 家系2胚胎整倍体及突变连锁分析结果

图2 基于二代测序的囊胚DMD基因SNP单倍型连锁分析结果

基于纳米孔测序DMD突变检测结果

利用三代测序牛津纳米孔测序平台对两个家系DMD突变携带者进行测序。利用三代测序长读长优势，在同一条read或contig序列上同时检测到DMD基因突变位点及上下游1 Mb范围内的SNP标记为携带致病突变的单倍型，称为 hap1；无DMD 基因突变的read或contig序列1Mb范围内的 SNP 标记为正常单倍型，称为 hap2。 1 号家系鉴定出 1085 个有效SNP位点， 2 号家系鉴定出 427 个有效SNP 位点，利用三代测序构建的SNP单倍型进行囊胚SNP连锁分析。结果显示，与通过二代测序获得的单倍型结果一致（如图 3A 与图 2A 对比、图 3B 与图 2B 对比）。利用 GRCh37 参考基因组， 结合IGV图谱可以精确鉴定DMD缺失/重复的位置。患者 1 的断裂点位于 chrX:32,562,666 和 chrX:32,591,938 处（图 4A、图 4B）；而患者 2 的断裂点则位于 chrX:32,711,038 和 chrX:32,904,034 处（图 4C、图 4D）。

产前诊断验证结果

家系1中，根据PGT-M检测结果结合Gardner 评分选择E3 胚胎移植后成功单胎妊娠。孕 18-20 周时，患者 1 接受了羊水穿刺检查。采用MLPA技术对DMD 基因进行产前诊断，结果显示 79 个外显子均未出现大片段缺失或重复，与第二代测序和纳米孔测序的PGT-M检测结果一致。家系 2 中，根据PGT-M检测结果结合Gardner，选择E5不携带母亲的 DMD 突变基因且染色体倍性正常胚胎移植后获得成功妊娠。采用MLPA技术进行产前羊水诊断，结果显示DMD 基因的 79 个外显子无大片段缺失或重复，与二代测序和三代纳米孔测序的PGT-M检测结果相符。

03 结论

在本研究中，针对 DMD 突变杂合子携带者，采用了纳米孔测序技术成功确定了 DMD 基因突变的精确断裂点，并利用与突变位于同一read或者contig上的SNP 构建了单倍型。随后，利用上述单倍型与胚胎 SNP 进行连锁分析，以判断胚胎是否遗传了母亲的突变基因。本研究首次证实了纳米孔测序技术在 DMD 临床 PGT-M 中的应用可行性。该研究为解决 DMD 突变相关 PGT-M 面临的挑战提供了切实可行的方案，尤其适用于家系不全、新发突变等无法通过基于二代测序家系遗传型方法开展单倍型分析的家庭。