D-荧光素钾盐，细胞/活体成像全指南！

一、简介

动物体内发光，一般是将萤火虫荧光素酶基因稳定整合至靶细胞染色体DNA，构建持续表达荧光素酶的细胞株。当细胞增殖、迁移或分化时，荧光素酶同步稳定表达。将稳定表达荧光素酶的细胞导入研究动物如大/小鼠体内，之后注射底物荧光素（luciferin），通过生物发光成像技术（BLI）来检测光强度变化，从而实时监测疾病发展状态或药物的治疗功效等。

D-荧光素钾盐（D-Luciferin Potassium Salt）是荧光素酶（Luciferase）的常用底物，其在540-600nm波长范围内发蓝绿光。其作用机制是在有氧环境下，荧光素在荧光素酶和Mg2+的催化作用下与ATP发生反应，生成荧光素-AMP复合体并释放出焦磷酸(PPi)。随后，荧光素-AMP复合体在O2的作用下进一步生成氧化荧光素，同时释放出CO2和H2O。在这个过程中，激发态的氧化荧光素返回到基态时会发出光子。荧光素所发的光更容易透过组织，在体内代谢较慢，而且特异性好。所以大部分活体成像实验采用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因。

二、应用场景

1、体外生物发光检测

（1）D-荧光素钾盐体外实验应用场景

报告基因检测：D-荧光素钾盐作为底物，用于基于荧光素酶（Luc）的报告基因检测。通过Luc催化其反应产生的生物发光强度，可定量反映与其融合的目标基因的表达水平；

高通量药物筛选：将荧光素酶基因（Luc）作为报告基因与目标基因融合表达，通过检测其生物发光强度，可快速筛选调控目标基因表达的化合物；

ATP含量检测：D-荧光素钾盐通过ATP依赖的荧光素酶反应，将细胞内ATP水平转化为生物发光信号，实现高灵敏度检测，可直接反映细胞代谢状态；

样品污染检测：ATP-荧光素酶生物传感系统通过检测活体生物共有的ATP信号，实现生物污染的高敏实时判定。

（2）体外D-荧光素钾盐使用方法

①用无菌蒸馏水溶解D-荧光素钾盐，配制成30 mg/mL的储存液 (100-200×) ，混匀。立即使用，或分装于-80℃避光保存（仅限冻融1次），避免反复冻融；

②用预热好的培养基将储存液稀释至0.15-0.3 mg/mL的工作液浓度（工作液推荐现配现用）；

③去除细胞培养基；

④待图像分析前，向细胞培养板内添加D-荧光素钾盐工作液，37℃ 孵育5-10 min，然后进行图像分析。

2、体内活体成像

一个完整的生物发光活体成像过程包括构建荧光素酶重组质粒、细胞转染和筛选、荧光素酶活性鉴定阳性克隆，再将阳性克隆细胞移植到体内建立动物模型，进而通过小动物活体成像系统检测动物体内特定部位发出的荧光信号。

（1）体内D-荧光素钾盐使用方法

①用无菌的DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制30mg/mL的荧光素的储存液，混匀。

②用0.2 µm滤膜过滤除菌。立即使用，或分装于-80℃避光保存（仅限冻融1次），避免反复冻融。使用时 4℃融化，实验前平衡至室温（避光）。

③腹腔注射（i.p.），按照150 mg/kg的荧光素/体重浓度进行注射（现配现用）。

④注射入体内10-15 min（待光信号达到最强稳定平台期）后进行成像分析。

注意：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。

三、常见问题解答

1、荧光素酶底物有哪些，如何选择？

D-荧光素、D-荧光素钾盐和D-荧光素钠盐是常见的荧光素酶底物，主要区别在于溶解和分散性能。D-荧光素钾盐在水和缓冲液中的溶解度高，且溶解速度较快，故在一般的生物学试验中常用D-荧光素钾盐。

2、D-荧光素钾盐如何保存？

（1）D-荧光素钾盐优先推荐于-80 ℃（若实验室无-80℃冰箱，可使用-20℃）避光储存，有效期12个月；

（2）复溶后的储备液推荐分装避光冻存于-80 ℃（仅限冻融1次），避免反复冻融，尽量在3个月内使用；

（3）工作液推荐现配现用。

3、体外细胞实验需要对细胞进行裂解吗？

D-荧光素钾盐体外细胞实验通常无需裂解，因其水溶性和脂溶性良好，可自然穿透细胞膜，直接在活细胞内与荧光素酶反应发光。但若需定量检测荧光素酶活性（如报告基因分析）或ATP水平，则需裂解细胞以释放酶，再与底物反应，通过发光强度定量酶/ATP含量。