从77%脱靶到零易位：Cas9安全性迭代升级

慢性肉芽肿病（CGD）由NADPH氧化酶缺陷引起，现有的干细胞移植疗法存在移植物抗宿主病、移植物衰竭或感染等高风险。CRISPR/Cas9介导的HDR基因治疗虽有望实现自体移植，却面临脱靶效应、染色体畸变及p53激活等问题。

近日，丹麦奥胡斯大学Jacob Giehm Mikkelsen联合Rasmus O. Bak团队在《Nature Communications》发表题为"Targeted gene editing and near-universal cDNA insertion of CYBA and CYBB as a treatment for chronic granulomatous disease"的研究，研究人员采用高保真Cas9变体及配对Cas9nickase策略，高效修复了CGD患者CD34+细胞中的CYBB/CYBA基因，显著降低了脱靶效应与细胞毒性，并根除了染色体易位的问题。其基因编辑细胞在小鼠体内实现长期多系植活，分化粒细胞功能恢复，为临床转化提供了安全有效的治疗新方案。

文章亮点：

1. 多重策略联合优化HDR：

首次在CGD模型中将i53 (53BP1抑制)、GSE56 (p53抑制) 和Ad5-E4orf6/7 (HDR增强) 的mRNA联合递送，在长期造血干细胞（ LT-HSCs）富集群体中显著提高了编辑效率和细胞活力。

2. 开发"泛X-CGD"治疗策略：

设计了靶向插入CYBB exon3-13 cDNA的方案，理论上可纠正约86%的X-CGD突变，为通用型疗法开发提供可行路径。

3. 安全性迭代升级：

从Std-Cas9到HiFi Cas9，再到配对D10A Cas9n，逐步将脱靶编辑率从约77%降至不可检测水平，并利用CAST-seq技术证实了配对nickase策略可消除染色体易位。

一、RNP+AAV6导致HSPC毒性与植活下降

研究者首先尝试使用标准流程（Std-Cas9 RNP+ rAAV6修复模板）在CYBA基因位点进行靶向插入（GFP报告基因）。虽然实现了较高的编辑效率（约40%），但编辑后的细胞表现出严重的DNA损伤反应：增殖减缓、集落形成能力（CFU）显著下降。

最关键的是，这些细胞在移植到免疫缺陷小鼠后，几乎完全丧失了长期多系重建能力，且移植后动物骨髓中检测到的编辑比例大幅下降，表明编辑对真正的LT-HSCs造成了负面筛选或损伤。

图 1. 基于RNP+AAV的靶向插入CYBA

二、联合递送HDR增强因子，优化LT-HSC编辑

为克服上述毒性，研究引入了三种mRNA：i53、GSE56和Ad5-E4orf6/7。三种mRNA的联合递送显著提高了在LT-HSC富集群体中的HDR效率，并增加了编辑后细胞的总数和活力。这表明该策略不仅提升了效率，还减轻了编辑过程对LT-HSC的伤害。

图 2. 优化的CYBA基因编辑方法

三、创立广谱性X-CGD治疗策略，攻克脱靶毒性难题

研究者针对CYBB c.252G>A突变，发现采用非特异性sgRNA与含沉默突变的修复模板效率更高，并进一步设计出"通用型"策略：通过HDR插入截短cDNA（exon 3-13），以纠正绝大多数X-CGD病例。该方案使编辑细胞成功恢复ROS生产功能。

初期使用sg3/Std-Cas9时，研究者发现脱靶编辑严重（OT1高达77.5%），并导致体内植活率极低（<1%）。为此，他们换用了HiFi Cas9，结果显示脱靶率有效降低至5%以下，且on-target效率保持不变。同时，编辑细胞的体外CFU能力显著恢复，在动物模型中实现了高达约67%的长期多系植活。

图 3. 用于校正 CYBB 变异的等位基因特异性编辑和 cDNA 插入

四、配对D10A Cas9n策略实现安全、长效的基因治疗

研究者采用D10A Cas9n尼克酶及一对sgRNA，通过制造邻近切口模拟双链断裂，显著降低了脱靶风险。

优化后的策略在动物模型中验证成功，编辑后的细胞不仅实现长期植活，且维持稳定编辑比例，证明了该方案可高效、安全地修饰LT-HSC，同时支持治疗性转基因的持久稳定表达。

图 4. 配对D10A Cas9n基因编辑的安全性与靶向效率

总结与展望

本研究通过采用高保真Cas9变体及配对Cas9n nickase系统，成功实现了慢性肉芽肿病相关基因的高效、安全编辑，并在动物模型中证实了编辑细胞的长期稳定植活，为CGD临床基因治疗提供了新策略。未来，需进一步提高LT-HSC内的HDR效率，减少编辑相关的毒性，推动安全、可规模化的临床级应用。