如何选择合适的重组蛋白表达系统？

重组蛋白表达是生物学、药物开发、结构生物学、诊断研发等领域的基础技术。选择正确的表达系统（host / host‐expression system）对于蛋白的产量、活性、结构完整性以及下游应用决定性意义。一个看似简单的蛋白如果表达系统选错，可能大量表达不出、折叠错误、承担错误的翻译后修饰（post‐translational modifications, PTMs）或形成包涵体，导致失败。

重组蛋白表达系统选择流程框架

某文献中提出一个 "四个关键问题（decision points）"的流程，用来引导研究者选择合适表达系统。

1. 蛋白来源是原核(prokaryotic)还是真核(eukaryotic)?

如果目标蛋白本质上为原核蛋白，则通常使用原核表达系统，如大肠杆菌 (E. coli)；如果是真核蛋白，则可能需要真核系统来支持复杂的折叠及 PTMs。

2. 若是真核蛋白，是否需要翻译后修饰（PTMs）、多少个二硫键(disulfide bonds)、蛋白分子量 (MW)、是否是膜蛋白 / 蛋白复合体？

例如，如果蛋白含有多个 (≥4) 二硫键，或需要复杂的糖基化 (glycosylation)，或 MW 很大 (>100 kDa)，或是大型膜蛋白，则倾向使用真核系统（酵母、昆虫或哺乳动物细胞）。

3. 选择哪种真核系统：酵母 (yeast)、昆虫细胞 (insect cells)、哺乳动物细胞 (mammalian cells)？

真核系统之间主要差别体现在 glycosylation 类型（N‐、O‐糖基化的差异性）、蛋白折叠能力、分泌与分泌路径 (secretion pathways)、成本与速度。

4. 是否需要高产量 / 规模化表达 /频繁表达？

如果对蛋白产量要求高或者需要反复表达，那么"稳定细胞株" (stable cell line) 或者"使用病毒载体系统"（如 baculovirus in insect cells）通常值得投入较多时间与资源；若只是短期或小规模实验，可能选择快速的 transient expression（如哺乳动物细胞的转染表达）或发酵型酵母/细胞系。

通过回答上述四个问题，可以在 E. coli、酵母、昆虫、哺乳动物或某些"异类"(exotic)系统中做出合理选择。

各表达系统的优缺点比较

其他需要考虑的关键因素

1. 目标用途（downstream application）

结构生物学（晶体学、电镜、NMR）：通常要求蛋白折叠良好、均一、尽可能接近天然修饰。

功能 /活性研究：需要确保 PTMs、辅因子、膜环境（若为膜蛋白）等正确。

抗体 /疫苗 /治疗蛋白：人性化修饰、免疫原性、糖型等至关重要。

工业酶 /大规模生物制剂：产量与成本要求往往比 PTMs 要求更宽松。

2. 蛋白稳定性 /可溶性 /折叠难度

多域蛋白、较大蛋白更易在表达中折叠不良。

二硫键数量：多个二硫键在还原环境中折断，需要分泌或在特定空间（如大肠杆菌的 periplasm）表达。

膜蛋白或含膜锚蛋白片段：表达在亲脂环境中或需要共表达伴侣／辅助蛋白。

3. 翻译后修饰（PTMs）

Glycosylation（N‐和 O‐型）；

磷酸化、羟基化、甲基化、脂肪酸化等；

蛋白末端剪切 / signal peptide；

有辅因子的蛋白，如需金属离子、辅酶、辅蛋白。

4. 表达产量与成本

含培养基、设备、人工、纯化过程等成本。

表达周期（从构建载体到得到纯化蛋白所需时间）。

规模试验 vs 规模生产的可行性。

5. 时间与资源限制

实验室或企业是否具备相应系统的设施与经验。比如有些实验室对哺乳动物细胞操作熟练，有些则没有；是否可获得 baculovirus vector 系统等。

操作复杂性与安全性要求（病毒载体、动物细胞可能需要更严格的实验室条件）。

6. 免疫原性 /临床应用要求

若蛋白用于人体用途，需要人类类型的糖基化、低免疫原性。表达系统可能影响外源糖基、非人类糖残基等。

合规性（GMP 条件、纯度的要求等）。

7. 可扩展性

若将来需要大规模生产，表达系统必须具备从研究规模放大到生产规模的能力。

重组蛋白表达系统选择流程建议

1. 收集蛋白的基本信息

* 来源（物种、原核 or 真核）

* 氨基酸序列：是否存在 signal peptide, transmembrane domains, glycosylation sites, cysteine 二硫键数目等

* 分子量 /结构（单域／多域／复合体）

* 有无已知辅因子、必需的 PTMs

2. 确定目标与用途

* 是用于结构研究、功能验证、免疫反应、疫苗、诊断、药物开发或工业应用？

* 是否对蛋白活性 /折叠 /糖基化有严格要求？

* 所需蛋白纯度、数量、时间节点。

3. 初步选择表达系统类别

根据第一步中蛋白属性，如果蛋白简单 - 原核系统可尝试；若真核蛋白且需要多重 PTMs、复杂结构，则考虑真核系统。

4. 比较真核系统内的选项

若确定真核系统，需要在酵母、昆虫、哺乳动物间比较：哪个可以提供所需 glycosylation 类型、分泌效率、成本、设施支持等。

5. 评估时间／资源与实验室能力

* 是否有经验做哺乳动物细胞转染或稳定株？

* 是否有 baculovirus 操作经验？

* 是否有设备、培养基、无菌操作支持这些系统？

6. 进行小规模试验（pilot）

在候选系统中做几个小规模表达测试，以验证可溶性、产量、活性或正确修饰。

7. 优化表达构建 /条件

* 载体选择，如强启动子、融合标签（tag）以帮助折叠或纯化、定位信号等。

* 密度、温度、诱导条件、共表达伴侣 /辅因子等。

* 如果是在真核系统中，检测 glycan 类型、翻译后修饰状态。

8. 决定最终系统并扩大规模

如果目标是生产大量蛋白或长期用途，投入建立 stable cell line 或 scale‐up insect / mammalian batch /发酵系统。

基于上述分析，下面是几个总结性建议，可用作快速参考：

先不要急于选最"高级"的系统，先评估蛋白属性与需求；往往一个简单系统已经足够。

规划好 downstream 活性／修饰要求，如果功能性依赖 PTMs 或结构完整性，真核系统一般不可或缺。

做好 pilot 试验，不同系统中小型表达以比较可溶性、产量及活性。

考虑成本与时间投入，尤其是设备、培养材料、纯化过程、操作复杂性等。

查看已有文献中的类似蛋白表达案例，经验可借鉴。

准备回退方案，例如如果在 E. coli 出包涵体，就尝试降温、融合标签、分泌到 periplasm，或切换到 insect / mammalian 系统。