分子互作技术服务介绍：微量热泳动技术MST

常见分子互作技术

背景

微量热泳动（MST）是一种生物物理技术，通过检测红外激光诱导温度变化所导致的荧光信号变化，来测量两个分子间相互作用的强度。荧光信号的变化范围与配体和荧光靶标的结合相关。总体而言，MST基于荧光分子在温度梯度内的运动。MST在pM到M的浓度范围内也有广泛应用，且样品消耗量极少，仅需几微升；此外，无需固定目标蛋白。你既可以给目标蛋白添加荧光标签，也可以利用靶标的固有荧光。在任何情况下，一个结合伴侣被荧光标记，而另一个结合伴侣保持无标记状态。荧光标记的分子成为报告分子，因此很容易探测到由结合引起的MST信号变化。实验结果通过软件自动分析，从而精确地计算Kd值。

原理：MST的核心原理基于热泳现象所进行的。利用红外激光在溶液中产生局部温度梯度，通过荧光标记监测分子因结合导致的大小、电荷、水合层等特性变化所引起的热泳运动轨迹改变，从而定量分子间相互作用。其主要原理可以分成以下几个部分：a）温度梯度驱动泳动；b）分子特性决定泳动行为；c）结合引起性质改变；d）检测结合事件：两分子结合后MST轨迹发生显著变化，通过高灵敏度荧光检测其中一个荧光标记的分子，可以进行实时监测；e）定量分析：测量不同配体浓度下靶分子MST轨迹的变化幅度，即可绘制结合曲线，进而计算出精确的结合常数（KD）。

（数据来源Plach MG , et al. Bio Protoc. 2017）

实验步骤/流程

（1）荧光标记：选择相互作用的两个分子（A和B）中的一个（通常是靶分子，如蛋白质）进行荧光标记。标记物需不影响分子的结合活性。常用标记方法有NHS化学标记、His-tag标记荧光染料等。

（2）样品准备：准备荧光标记蛋白，设蛋白储备液（如50 μL），按1:100稀释（加4950 μL缓冲液），取10 μL该稀释液加到各配体稀释液，室温孵育（时间依亲和力定，亲和力低可延长）。

（3）上样与测量：将孵育后样品上样到仪器，启动MST分析，检测分子间相互作用的热力学、动力学参数。

（4）数据分析：将不同配体浓度下的泳动参数对配体浓度作图，得到结合曲线，通过非线性拟合，计算出结合常数（KD）、Hill系数、化学计量比等参数。

（数据来源 Romain M , et al. Bio Protoc. 2020）

MST特点：

（1）超高灵敏度：仅需微量样品（纳升体积、皮摩尔级浓度），适用于稀有或难纯化的生物分子（如膜蛋白）；可检测弱结合（KD范围覆盖pM~mM），尤其擅长片段筛选（Fragment-based screening）。

（2）溶液中原位检测：a）无需固定化：分子自由扩散，避免固相载体引起的假阳性或构象限制；b）近生理环境：直接在缓冲液、细胞裂解液甚至含血清/去垢剂的复杂体系中测量，结果更具生理相关性。

（3）快速高效：单次测量仅需数分钟，可高通量并行分析（如96孔板形式），适合快速筛选。

（4）普适性：兼容各类生物分子（蛋白质、核酸、小分子、离子、脂质体等），可研究蛋白-蛋白、蛋白-核酸、蛋白-小分子等多种相互作用。

（5）直接定量参数：直接输出结合常数（KD）、化学计量比、Hill系数，部分模式还可获取动力学参数（kon/koff）。

（6）低样品消耗：每次测量仅消耗微升级样品，显著降低实验成本。

MST的应用：

1. 生物分子相互作用研究：蛋白质-蛋白质相互作用（如：抗原与抗体）；蛋白质-核酸相互作用（转录因子和DNA/RNA）；蛋白质-小分子相互作用(如：靶蛋白与药物筛选)；核酸-核酸相互作用（如：核酸杂交）；

2. 药物发现与开发：如高通量筛选（HTS）验证，构效关系研究

3. 抗体表征：测定抗体与抗原的结合亲和力（KD）

4. 核酸适配体筛选与表征

案例：

蛋白-蛋白相互作用：

周睿等人通过GST Pull-down实验，鉴定出肌球蛋白-5a Myo5a的中间尾部结构域（Myo5a-MTD）与货物蛋白黑素亲和素（Mlph）的肌动蛋白结合结构域（Mlph-ABD）之间的相互作用，并利用等温滴定量热法（ITC）或微量热泳动（MST）来获取了Myo5a-MTD与Mlph-ABD之间的解离常数（为562±169 nM）。Ingvild Gudim等也通过微量热泳动（MST）技术，测定了三种不同的黄素氧还蛋白还原酶（FNRs）与一种类黄素氧还蛋白（NrdI，来自枯草芽孢杆菌）之间的结合亲和力，并介绍了NrdI对于激活Ib类核糖核苷酸还原酶（RNR）系统中锰结合形式至关重要。而RNR是所有生物体内DNA复制和修复所需脱氧核糖核苷酸从头合成的唯一来源。

（数据来源左： Rui Zhou , et al. Bio Protoc. 2025；右：Gudim I , et al. Bio Protoc. 2017）

蛋白质-核酸相互作用：

Gregory T等人描述了一种使用酶联寡核苷酸分析（ELONA）和微量热泳动（MST）技术获得DNA适配体与SARS-CoV-2结合曲线的实验方案。这些方法可用于测定适配体与传染性SARS-CoV-2的结合亲和力，以及该适配体针对经紫外线灭活而失去传染性的SARS-CoV-2和其他病毒的选择性。

（数据来源Pawel GT , et al. Bio Protoc. 2022）

蛋白质-短肽相互作用：

Plach等人详细描述两种MST实验方法，用于分析（1）真核生物RNA聚合酶II的特定肽段与真核生物转录延伸复合物的一个蛋白质亚基之间的相互作用，以及（2）N端组蛋白尾部肽与表观遗传学"阅读器"蛋白质之间的相互作用。这些实验表明，MST能够表征由肽的微小变化（例如，特定丝氨酸残基上仅一个磷酸化修饰）所引发的蛋白质-肽相互作用。

（数据来源 Plach MG , et al. Bio Protoc. 2017）

蛋白质-小分子相互作用：

2019年山东大学吴大雷等人结合晶体学、生物物理学和MST的研究方法，对缺氧诱导因子-2/HIF-2α（一种异二聚体转录因子，由对氧敏感的HIF-2α亚基与其必需的伴侣亚基ARNT发生二聚化而形成）的化学配体进行了探索，并发现了其化学结构不相关的拮抗剂（T1001），它们采用相同的作用机制：结合后会将HIF-2α PAS-B口袋内的残基M252推向ARNT亚基，从而削弱异二聚化作用。

（数据来源Wu D , et al. Nat Chem Biol. 2019）

抗原与抗体相互作用：

S蛋白RBD抗体CR3022，通过微量热泳动（MST）检测显示，其与典型SARS-CoV-2 S蛋白的亲和力（解离常数K_D）为1.09 nM。进一步通过MST检测CR3022与不同变异株（B.1.1.7/Alpha、B.1.351/Beta、B.1.617.2/Delta、B.1.617.1/Kappa、P.1/Gamma）S蛋白的亲和力。结果显示，所有检测变异株的K_D值均处于nM范围，表明CR3022对它们均保持高亲和力（注：K_D值越低，结合越强）。

（数据来源Antibodies-online 官网）

我们基于已有重组蛋白和单B细胞重组兔单抗开发筛选平台，技术团队核心成员拥有多年的蛋白质研究、生物大分子互作分析及蛋白质表征分析研究经验，公司建立了严谨的方法开发优化流程，并通过了ISO9001质量管理体系，确保每一项检测实验都能获得最佳的检测结果。目前对外提供蛋白互作、抗体筛选等亲和力检测服务。