大鼠小胶质细胞提取攻略

一、实验前准备

1、动物：

新生 1-3d SD 大鼠乳鼠全脑（含皮质、海马、纹状体）。

2、主要试剂

• DMEM

• 胎牛血清

• 双抗

• 0.25 % 胰蛋白酶-EDTA

• 组织解离液

• 10xPBS

• 1xPBS

• Percoll

• 70um 细胞筛网

• 细胞培养皿（35mm）

• 细胞培养皿（60mm）

二、小胶质细胞提取与分选

1、酶消化

（1）将脑组织剪碎成 0.5-1mm3 的小组织块，将组织块（100-200mg）转移到 2mL圆底管中，加入1mL 消化液，37℃水平摇床 80rpm 的速度轻轻摇动孵育30-40min（根据组织糜烂状态适当延长时间）

（2）从水平摇床中取出圆底管，剧烈涡旋管 10-20s，通过 70um 细胞筛网（cat: abs7232）过滤，用 10mL PBS 冲洗细胞筛网;

（3）收集含有细胞的滤液到 50mL 管中，20℃下400g离心5min，弃上清。

2、Percoll 密度梯度纯化

（1）30% Percoll 溶液

Percoll 细胞分离液与 PBS 缓冲液(10x)按体积比 9:1 混合，配制等渗 100% Percoll 母液。

用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按体积比 3:7 混合，配制 30%等渗 Percoll 溶液。

（2）37% Percoll 溶液

Perco11 细胞分离液与 PBS 缓冲液(10x)按体积比 9:1 混合，配制等渗 100% Percoll 母液用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按体积比 37:63混合，配制 37%等渗 Percoll 溶液

（3）70% Percoll 溶液

Perco11 细胞分离液与 PBS 缓冲液(10x)按体积比 9:1 混合，配制等渗 100% Percoll 母液用 100% Percoll 母液和 1xPBS 按体积比 7:3混合，配制 70%等渗 Percoll 溶液；

（4）吸取 4 mL 70% percoll 深入 到 15mL 离心管底部；

（5）用 4mL，37%percoll （cat: abs9102）重悬细胞沉淀，沿着管壁缓慢加入含4mL 50% percoll 离心管中，覆盖在 70% Percol 溶液的顶部形成密度梯度；

▲注意：不要破坏 37% Percoll和 70% Percoll 与细胞的悬液的分界面，37%和 70% percoll 现配现用。

（6）吸取 4mL 30% percoll，沿着管壁缓慢15mL 离心管中，覆盖在 37% Percoll细胞溶液的顶部形成密度梯度；

（7）900xg，20℃，离心 45min，升速(ACC)1，降速(DEC)1；

（8）离心结束后，吸取中间 37% 与70% Percoll界面层细胞（富含 TC）至新的 15mL 离心管中，加入3倍体积 4℃预冷 1xPBS，上下颠倒混匀， 4℃下 400g离心 5min，弃上清；

（9）按照步骤（8）重复清洗一次，弃上清得到细胞。

三、培养与传代

（1）培养基：DMEM + 10% FBS + 1% 双抗。

（2）每 2-3 天换液；细胞长至 80% 汇合时，0.25% 胰酶-EDTA 消化 1-2min，1:3传代。

（3）前 3 代以内功能最稳定，建议实验在此窗口内完成。

四、注意事项

1、消化时间勿超 90min，以免降低活率。

2、Percoll 离心后收细胞时，界面层需精准吸取，避免混入红细胞或颗粒细胞。