杆状病毒&昆虫细胞——蛋白表达的黄金搭档

随着生命科学与生物技术的不断发展，对功能完整、高质量的重组蛋白需求日益增加。无论是结构生物学研究、诊断试剂开发，还是疫苗与生物制剂的生产，都离不开稳定而高效的蛋白表达系统。传统的细菌表达体系虽然成本低廉、操作简便，但难以进行复杂的真核修饰；而哺乳动物细胞虽能提供最接近天然状态的蛋白，但周期长、成本高、操作复杂。

在这种背景下，杆状病毒-昆虫细胞表达系统（Baculovirus-Insect Cell Expression System，简称 BEVS）逐渐成为科研与工业生产中的"黄金搭档"。该系统结合了真核细胞的折叠与修饰能力，以及较低的培养成本和良好的表达效率，已经广泛应用于疫苗研发、蛋白药物生产和基础研究。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统的基本原理与组成部分

1. 杆状病毒（Baculovirus）

杆状病毒（如 Autographa californica 多核包涵体病毒 AcMNPV，或 Bombyx mori 的 BmNPV）是昆虫的核多包涵体病毒 (nuclear polyhedrosis viruses)。这些病毒天然只感染昆虫，不致病于脊椎动物，因此安全性较高。利用这些病毒为载体将目的基因插入其基因组中，然后用重组病毒感染昆虫细胞，表达目标蛋白。文献中很多是在 AcMNPV 与常用昆虫细胞系 Sf9、Sf21 或 High Five（BTI‐Tn‐5B1‐4）细胞中操作。

2. 昆虫细胞系

常用昆虫细胞系包括：

Sf9/Sf21：源于 Spodoptera frugiperda 的卵巢组织，常用于 AcMNPV 系统。易于悬浮培养、血清‐或无血清培养基，有较好适应性。

High Five（BTI‐Tn‐5B1‐4）：源于 Trichoplusia ni，常用于分泌蛋白高产，尤其是那些分泌或复杂修饰蛋白。 High Five 在某些情况下产量可以显著高于 Sf9。

3. 目标基因表达流程关键步骤

①．构建转移质粒 (transfer vector)，将目的基因置于强病毒启动子下（如 polyhedrin 或 p10），常伴有信号肽、标签 (His, V5 等) 以助于分泌和纯化。

②．与杆状病毒 DNA（或称 bacmid）通过同源重组或转座子 (transposition) 等方式生成重组病毒。

③．用重组病毒感染昆虫细胞，细胞在感染中经历病毒生命周期，外源蛋白在恰当的时期被强力病毒启动子驱动表达。表达期间细胞进行翻译后修饰，如糖基化、二硫键、切割、折叠等。

④．蛋白收获与纯化，包括细胞裂解或分泌到培养上清的蛋白，以及下游处理（去除病毒、去除宿主蛋白、糖基型分析等）。

杆状病毒‐昆虫细胞系统的主要优势

1. 真核表达、修饰接近天然状态

相比细菌系统（如 E. coli），昆虫细胞具备真核生物很多重要的后翻译修饰能力，如：

Ø 正确的蛋白折叠，包括分子伴侣（chaperone）辅助。

Ø 二硫键、信号肽切割等。

Ø N‐linked 和 O‐linked 糖基化。虽然昆虫细胞所进行的蛋白 N‐糖型 (N‐glycosylation) 与哺乳动物不同（少分支、高甘露糖含量、缺乏唾液酸等末端修饰），但通过工程改造可改善 "人性化" 糖基型。

因此，对于结构功能敏感（如蛋白质的活性依赖于正确折叠或糖基化）的蛋白，BEVS 常比细菌、酵母等系统更可靠。

2. 高表达水平与快速周期

Ø 强病毒启动子（如 polyhedrin、p10）非常强，可以在感染晚期驱动大量外源蛋白表达。

Ø 可以在短时间（几天到一周）内得到可用的表达株，对研究和开发工作流敏感型项目非常适合。

Ø 悬浮培养、规模化容易：昆虫细胞在适合条件（温度约 27-28°C，无血清或低血清培养）下生长，对设备要求和运营成本通常低于哺乳动物细胞。

3. 安全性高、宿主范围窄

杆状病毒天然只感染昆虫，不感染哺乳动物、植物或人类细胞，因而在生物安全方面有天然优势。

宿主细胞系（如 Sf9、High Five）多为标准、受控系，不带致病因素。风险较低。

4. 多样的应用场景

分泌蛋白、膜蛋白、复杂蛋白复合体、病毒样颗粒 (Virus‐Like Particles, VLPs)、疫苗抗原等都可以表达。BEVS 在疫苗设计中已有成功案例，例如某些基于 VLP 的疫苗。

在基因治疗载体生产（例如用于 Adeno‐Associated Virus, AAV 的结构蛋白），BEVS 也日益被采用。

昆虫蛋白表达技术进展与优化策略

1. 病毒载体工程化

减少不必要病毒蛋白或酶的影响：例如敲除杆状病毒中可能引起蛋白降解或影响宿主健康的基因，使其更"无害"。

增强启动子 / 增强子组合设计：使用例如 hr5 + IE1 + p10 或 hr5 + OpIE2 + p10 的启动子 /增强子串联组合，以提高晚期或非常晚期的表达效率。文献中指出这种组合在许多病毒株中能显著提升外源蛋白产量。

信号肽优化：对分泌蛋白，合适的信号肽非常关键。有研究表明向信号肽末端添加某些极性氨基酸（如天冬氨酸、天冬酰胺）有助于分泌效率。

2. 昆虫细胞株 /宿主工程

改善糖基化途径：引入哺乳动物型糖基化酶，让昆虫细胞能够生成更类似哺乳动物的复杂 N‐糖型链。文献中已有工程昆虫细胞系能够产生带唾液酸或带有分支糖链的糖型。

适应性实验室进化 (Adaptive Laboratory Evolution, ALE)：通过适应性演化使细胞系在高密度、强表达状态下更加稳定，减少应激反应和蛋白降解。

使用高蛋白生产细胞系：如 High Five 相对于 Sf9 在某些蛋白分泌或复杂蛋白表达上有优势。根据最近文献，High Five 细胞在"baculovirus‐free"表达系统中也表现出良好性能。

3. 病毒‐无系统（Baculovirus‐Free Systems）

一些研究探索不使用病毒感染，而是仅用质粒转染昆虫细胞表达外源蛋白。这种方式可以避免病毒制作、放大带来的不稳定性和生物安全问题。文献中提到在 High Five 细胞中已有成功的案例，用于分泌抗体、抗原等，效率与成本都具备竞争力。

4. 应用案例与产业化成果

在 AAV 载体生产中，应用 IC‐BEVS 提高结构蛋白表达与载体纯度，并缩短生产周期。

在试剂或诊断用途的抗体表达，有研究比较 High Five 细胞生成抗体与哺乳动物细胞系统（如 Expi293F）表达在产量、聚集态稳定性等方面的不同，昆虫细胞在某些目标蛋白"难以表达"的情形下具有优势。

杆状病毒结合昆虫细胞系统可以说是当前重组蛋白表达中极具竞争力的一个选择。它兼具真核系统的翻译后修饰能力、高表达水平、较好的安全性与成本效率，是表达复杂蛋白、疫苗抗原、病毒样颗粒、多蛋白复合体等目标的理想平台。