一种识别WT1肽-MHC分子的TCR样单域抗体的计算机设计

TCR样抗体能够识别肽段负载的I类MHC（pMHC）复合物，从而实现对癌细胞的精确靶向，但开发具有高特异性和亲和力的单域结合子仍具挑战性。这里报道了一种TCR样单域抗体（sdAb）的计算机设计及实验验证，该抗体可特异性识别由HLA-A*02:01呈递的源自WT1的肽段RMFPNAPYL。从结合RMF/HLA-A*02:01的Fab抗体晶体结构出发，将VH结构域重新设计为稳定且可溶的曲妥珠单抗来源的VH支架。所得的sdAb（RMFsdAb）覆盖了全部9个肽段残基，并且对呈递不同肽段的对照pMHC无结合。通过与人血清白蛋白结构域III（HSA D3）融合，其生物物理特性得到改善，得到了单分散的HSA D3-RMFsdAb，其对RMF/HLA-A*02:01的亲和力为81nM，且具有特异性。进一步构建了双价形式（RMFsdAb-HSA D3-RMFsdAb），使其表观亲和力显著提高至0.4nM。当将HSA D3-RMFsdAb表达于CAR-T细胞上时，其可作为抗原识别域，在RMF/HLA-A*02:01阳性细胞存在的情况下选择性激活T细胞。研究结果展示了一种可行的策略，可用于开发针对pMHC治疗的高特异性、以肽段为中心的TCR样单域抗体。

I类MHC分子由多态性的HLA重链和β2M轻链组成。这类分子几乎表达于所有有核细胞的表面，在免疫监视中发挥关键作用，使机体能够识别受感染或发生恶变的细胞。细胞表面的pMHC抗原持续受到TCRs的监控。当pMHC呈递出非自身肽段或异常的自身肽段时，可激活相应的T细胞，随后这些T细胞会识别并杀伤呈递该抗原的细胞。

开发针对目标pMHC的TCR是当前研究和制药领域的一个重要重点。目前已有两种靶向pMHC的疗法获得临床批准：Tebentafusp是一种由TCR衍生的双特异性T细胞衔接器（BiTE），靶向呈递gp100来源肽段的HLA-A*02:01阳性黑色素瘤细胞；以及Afatresgene autoleucel，一种过继细胞疗法，靶向呈递MAGE-A4来源肽段的HLA-A*02:01阳性滑膜肉瘤细胞。

TCR样抗体是一种单克隆抗体，可模拟TCR在识别pMHC方面的特异性。这些抗体将抗体的抗原结合能力与识别由MHC分子呈递的特定肽表位的能力结合起来。由于其稳定性、多功能性和易于生产性，TCR样抗体成为TCR为基础的治疗方式的一种可行替代方案。已有数种靶向pMHC的TCR样抗体被开发出来，并显示出良好的临床潜力。除非其靶抗原在癌细胞上异常表达，否则这些抗体不能直接用于治疗。相反，它们需要转化为特殊的结构，如T细胞双特异性抗体、双特异性T细胞衔接器（BiTE）、CAR或STAR（合成TCR和抗原受体），其中TCRα和TCRβ恒定区分别与TCR样抗体的VL和VH结构域融合。所有这些结构均通过与pMHC抗原特异性结合来激活T细胞而发挥作用。

开发具有可忽略交叉反应性的TCR样抗体具有挑战性。这是因为实际抗原的尺寸，即在HLA分子上呈递的肽段，与MHC相比要小得多。此外，Fab的结合表面积通常大于被结合肽段所形成的表面积，常常与在不同亚型间相似的HLA区域发生相互作用，从而可能导致与正常细胞上非目标pMHC的潜在交叉反应性。纳米抗体由于其较小的表位结合表面，可能作为TCR样抗体在降低交叉反应性方面具有优势，并且已有少数TCR样纳米抗体被开发并测试了在过继细胞治疗形式中的有效性。

除了传统的通过阳性与阴性筛选的文库方法外，已有研究报道了一种重新改造预选TCR样抗体的策略，用于靶向不同的pMHC抗原，从而能够分离出新的TCR样抗体。此外，针对特定pMHC设计非TCR样的人工支架结构也已有相关报道。

WT1是一种锌指转录因子，在多种癌症中高度表达，但在正常成人细胞中极少表达。由WT1衍生的肽段通过MHC呈递为9个或10个氨基酸的长度。一种9个氨基酸长度的WT1肽段（126-RMFPNAPYL-134，简称"RMF"）由HLA-A*02:01亚型呈递。已有研究开发出能够识别RMF与HLA-A*02:01-β2m复合物（为简便起见，后文简称为HLA-A*02:01）的TCR或TCR样抗体，并将其用于针对多种癌症（如AML）的免疫治疗策略中。

迄今为止，尚未有针对RMF/HLA-A*02:01复合物的TCR样纳米抗体被报道。这里报道了一项研究，将抗Her2抗体曲妥珠单抗的VH结构域重新用于开发一种TCR样单域抗体（sdAb）。该单域抗体能够完全覆盖结合肽的全长，并且对载有p53来源肽段的HLA-A*02:01没有交叉反应性。

抗体与RMF肽-MHC复合物结合的结构信息

曾有研究报告了一种针对RMF/HLA-A*02:01复合物的TCR样抗体Q2L，但未提供结构信息。测定了Q2L-Fab与RMF/HLA-A*02:01结合状态下的晶体结构，分辨率为2.8Å（表1）。该不对称结构单元包含两个Q2L-Fab/RMF/HLA-A*02:01分子。出乎意料的是，VL结构域与其对应的VH结构域分离，并在两个Fab分子的VL结构域之间形成了有限的分子间相互作用。这些相互作用较弱，可能代表的是晶体中的接触作用，而非在溶液中稳定的同源二聚体相互作用。此外，一个Fab分子的VL结构域比其自身VH结构域更接近另一个Fab分子的VH结构域。因此，每个RMF/HLA-A02:01复合物与一个Fab分子的VH结构域以及另一个Fab分子的VL结构域发生相互作用（图1）。这种涉及HLA-A02:01中的His145和Lys146以及VL中的Ser50和Leu53的相互作用较弱，在溶液中不太可能发生。

表1 数据收集与优化统计。

通常，VH和VL的框架区在这两个结构域之间形成一个疏水性界面，而Q2L抗体保留了有助于这一界面形成的保守疏水性残基（VL中的Tyr36、Phe98和VH中的Leu45、Phe103）。因此推测，该抗体的VH和VL结构域在游离状态下相互结合，但在通过VH结合RMF/HLA-A*02:01时彼此分离，从而实现一种独特的结合模式，而这种模式在VL与RMF/HLA-A*02:01之间因严重空间位阻而无法实现。所观察到的异常结构特征表明，该抗体的VH结构域单独与pMHC形成了紧密的相互作用。在VH与RMF/HLA-A*02:01结合过程中，还有两项显著的结构特征：首先，VH与RMF肽的全部9个残基结合，但仅与HLA-A*02:01的6个残基形成有限的接触（图1B，底部）；其次，Trp47的吲哚环位于HLA-A*02:01的一个"壁状"α螺旋（α2）的上方，提示其可能在pMHC对接中起到锚定作用（图1C）。Trp47是一个高度保守的框架区残基，位于VH结构域中常见的β链结构位置上。推测，这种对接构象可能可通过一个sdAb重现。如果确实如此，则该sdAb及其对接位置可作为发现TCR样sdAb的通用起点，这些sdAb主要通过与肽段的相互作用靶向多种pMHC，从而降低对非靶标pMHC的交叉反应性。

图1 Q2L-Fab/RMF/HLA-A*02:01的结构特征

靶向RMF/HLA-A*02:01的sdAb设计

随后探究了Q2L的VH结构域是否能够以可溶形式表达并表现出类似的结合亲和力。然而，VH结构域（残基1-115）在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中表达时形成了可溶性聚集体。这与Q2L的Fab片段形成鲜明对比，后者可被纯化为均一的单体形式，表明Q2L的VH结构域单独存在时并不稳定。此前，曲妥珠单抗引入五个点突变后，得到了可溶性的单体VH结构域（Tra_VH），并且其晶体结构已有报道。尝试将Q2L VH的关键抗原结合残基移植到Tra_VH上。Tra_VH与Q2L_VH/RMF/HLA-A*02:01的结构比对显示，除了CDR3H环外，其余部分与RMF/HLA-A*02:01没有主链冲突（图2A），这表明将其转化为可溶性sdAb以结合RMF/HLA-A*02:01是可能的。在移植CDR3_H环、在CDR2H上移植两个抗原结合位点残基（Y57E、R59L），并引入Y33A突变以缓解空间位阻之后，对模型进行了Rosetta FastRelax处理，仅将残基33指定为可重新设计的位置。结果未观察到显著的主链位移，而苏氨酸在该位置最常富集。最终选定的设计还包括一个合理的F103E替换，以取代暴露的苯丙氨酸。该设计被命名为RMFsdAb，与原始的Tra_VH序列相比，总共包含7个点突变以及一个四残基缺失（图2B）。考虑到Chai-1能够准确预测Q2L_VH/RMF/HLA-A*02:01的结构，预期RMFsdAb/RMF/HLA-A*02:01的建模结果也是可靠的。预测的RMFsdAb/RMF/HLA-A*02:01模型与Q2L_VH/RMF/HLA-A*02:01晶体结构非常接近，关键的抗原结合残基占据着相似的空间位置（图2C）。值得注意的是，尽管Q2L_VH与Tra_VH在CDR2H环上存在构象差异，RMFsdAb中该环上的Y57E和R59L替换仍能与RMF/HLA-A*02:01兼容（图2C）。

为了进行实验验证，在大肠杆菌中表达了RMFsdAb。尺寸排阻色谱结果显示，大约70%的蛋白以单体形式洗脱，其余为二聚体形式。BLI亲和力测定显示，该单体形式与RMF/HLA-A*02:01结合的解离常数（KD）为76nM（图2D）。接下来，为了评估RMFsdAb的特异性，制备了载有p53(R175H)肽（HMTEVVRHC）的HLA-A*02:01分子以及已知可特异性结合此pMHC的抗体Fab片段H2。在BLI结合实验中，H2的完整抗体形式能够强烈结合p53(R175H)/HLA-A*02:01，而RMFsdAb则未表现出可检测的与此pMHC（具有相同的HLA亚型）相互作用（图2D）。

图2 RMFsdAb的设计、纯化及结合亲和力测定。

HSA D3-RMFsdAb的构建与表征

为了解决RMFsdAb的异质性问题（图2D），将人血清白蛋白（HSA）第三结构域（HSA D3；残基384-585）进行融合，该结构域具有高溶解性，并可改善融合蛋白在溶液中的行为。所得的融合蛋白HSA D3-RMFsdAb在尺寸排阻色谱柱上洗脱为单一峰，对应单体蛋白的大小（图3A）。融合蛋白对RMF/HLA-A*02:01的结合亲和力与单独的RMFsdAb相当（KD分别为81nM和76nM，图3A）。这些结果表明，HSA的第三结构域显著改善了RMFsdAb在溶液中的行为，同时未影响其对RMF/HLA-A*02:01的结合亲和力。

接下来，使用T2细胞和721.221细胞进行了细胞结合实验，以评估HSA D3-RMFsdAb在细胞表面与肽段负载的HLA-A*02:01结合的特异性。T2细胞系来源于人类T细胞白血病细胞系，天然缺乏抗原加工相关转运蛋白（TAP）。由于这一缺陷，只有在提供外源性肽段的情况下，细胞表面才能形成稳定的pMHC复合物。721.221细胞系是一种人类B淋巴母细胞系，其内源性HLA-A、HLA-B和HLA-C表达缺失，但仍保留TAP的表达；经修饰的721.221（HLA-A*02:01+/TAP-）细胞系稳定表达HLA-A*02:01，但缺乏TAP的表达。用RMF肽段对T2细胞进行脉冲处理，并通过流式细胞术分析与HSA D3-RMFsdAb结合的细胞。与未脉冲处理的对照组相比，RMF脉冲处理的T2细胞中明显出现了HSA D3-RMFsdAb阳性群体（图3B）。此外，与BLI结合分析结果一致（图2D），RMFsdAb-HSA并未结合经p53(R175H)肽段脉冲处理的T2细胞（图3B）。这些结果强烈表明，HSA D3-RMFsdAb能够特异性地与RMF/HLA-A*02:01结合，而不会与p53(R175H)/HLA-A*02:01发生交叉反应，也不会非特异性地结合细胞表面其他组分。

为了确定RMF肽中对结合至关重要的残基，并评估HSA D3-RMFsdAb对该HLA上另一类似肽段可能存在的交叉反应性，研究人员使用包含定点丙氨酸替代的RMF肽（RMF_1A至RMF_9A，RMF_6S为Ala至Ser替代）进行了细胞结合实验。对照组为p53(R175H)肽。流式细胞术分析显示，在Arg1、Met2、Pro4或Tyr8位点的替代显著降低了HSA D3-RMFsdAb的结合能力，表明这些残基对识别至关重要（图3B）。在RMFsdAb/RMF/HLA-A*02:01预测结构中，除了Met2以外，这些肽残基均与RMFsdAb发生疏水性或离子相互作用（图3B）。在Q2L Fab/RMF/HLA-A*02:01结构中，Met2深埋于HLA结合槽内部，与HLA-A*02:01的Tyr7、Phe9、Met45、Val67、His70和Tyr99发生相互作用。尽管Met2无法被抗体接触，但M2A取代可能会破坏肽与HLA-A*02:01的结合，从而间接消除HSA D3-RMFsdAb的相互作用。注意到，Asn5和Leu9位的丙氨酸取代相比原始肽增强了RMFsdAb与HAS的结合能力，可能是通过改变整体肽-HLA-A02:01相互作用的方式，从而有利于抗体识别。

图3 HSA D3-RMFsdAb的构建与测试

HSA D3-RMFsdAb CAR-T细胞的激活

为了评估HSA D3-RMFsdAb是否能在CAR结构中激活效应T细胞，对Jurkat T细胞进行了改造，使其表达包含HSA D3-RMFsdAb的CAR（图4A）。这些CAR-T细胞被命名为HSA D3-RMFsdAb CAR-T细胞，将其分别与负载RMF肽或p53(R175H)肽的T2细胞共培养，并通过ELISA检测随后的IL-2产生情况。RMF肽在浓度达到10nM时便诱导了IL-2的浓度依赖性增加（图4B），而p53(R175H)肽即使在浓度达到10μM时也未能引发IL-2的产生。为了进一步评估激活的特异性，采用负载RMF肽的721.221（HLA-A*02:01+/TAP-）细胞重复了实验。与T2细胞类似，这些细胞在负载RMF肽后也表现出浓度依赖性的IL-2产生，但负载p53(R175H)肽时则无此现象（图4B）。总体而言，这些结果表明HSA D3-RMFsdAb CAR-T细胞可通过特异性识别靶细胞上的RMF/HLA-A*02:01复合物而被选择性激活。

为了评估HSA D3-RMFsdAb CAR-T细胞的激活是否与HSA D3-RMFsdAb对RMF肽的结合亲和力相关，使用T2细胞和721.221（HLA-A*02:01+/TAP-）细胞重复了实验，并用一系列肽段RMF_1A至RMF_9A以及RMF_6S进行了处理。作为对照使用的未修饰Jurkat T细胞未显示出任何肽段引起的激活反应。所有突变型肽段在两种细胞系中均表现出相对于野生型RMF肽的激活能力下降（图4C）。这种激活能力下降的程度与HSA D3-RMFsdAb对RMF/HLA-A*02:01的定性结合亲和力相一致（图3B），因为关键残基位置（M2A、P4A、Y8A）的丙氨酸取代导致了显著降低的激活水平，而Arg1Ala则是一个例外。在肽段加载量极低或为零的情况下，HSA D3-RMFsdAb CAR-T细胞在T2细胞（表达所有I类HLA）或721.221细胞上均未出现激活，这表明HSA D3-RMFsdAb不会与空载的HLA分子或其他细胞表面成分发生交叉反应。

图4 激活表达HSA D3-RMFsdAb CAR的Jurkat T细胞

RMFsdAb-HSA D3-RMFsdAb的双价结构

为了进一步增强HSA D3-RMFsdAb的结合强度，构建了HSA D3融合蛋白的一个二价变体。在此构建体中，一个RMFsdAb部分连接在HSA结构域III的N端和C端，生成了一个命名为RMFsdAb-HSA D3-RMFsdAb的二价融合蛋白。该二价融合蛋白表达良好，并通过尺寸排阻色谱纯化为单分散的单体（图5A）。这一结果表明，添加第二个RMFsdAb不会引起聚集，使构建体能够保持稳定的单体状态。

接下来评估了双价结合是否能够转化为更强的目标结合能力。BLI检测显示，双价RMFsdAb-HSA D3-RMFsdAb对RMF/HLA-A*02:01表现出显著增强的表观亲和力，其KD值为0.37nM（图5B）。这比单价HSA D3-RMFsdAb的靶标结合能力提高了约200倍，与两个抗原结合域产生的协同作用增益相符。与动力学数据一致，流式细胞术显示，双价结构比单价结构更强烈地结合RMF肽段处理的T2细胞（图5C）。值得注意的是，这种增强的结合具有抗原特异性：双价RMFsdAb-HSA D3-RMFsdAb对经p53(R175H)肽段处理的T2细胞未表现出可检测的结合（图5C）。因此，构建双价形式通过协同作用显著提高了对目标细胞的结合能力，同时保持了单价HSA D3-RMFsdAb的高度特异性。

图5 HSA D3-RMFsdAb的表征

总结

在治疗应用中，TCR样抗体必须具有极高的特异性，以最大限度地减少对健康细胞的脱靶pMHC结合和细胞毒性。这一挑战源于MHC结构的高度保守性以及所呈递肽段提供的表面积较小，这通常使得难以分离出仅针对肽段但又能耐受MHC多样性的结合物。这里通过设计一种以纳米抗体形式存在的TCR样抗体，主要识别结合状态下的肽段，同时避免与HLA产生显著的相互作用，从而应对上述挑战。

Q2L Fab的VH结构域表现出以肽为中心结合RMF/HLA-A02:01的能力，使其成为转化为单域形式的理想支架。然而，单独的VH结构域不溶。通过计算机设计，将CDR3移植和少量突变引入先前优化的单体VH支架中，从而获得了能够以数10nM亲和力结合RMF/HLA-A02:01的RMFsdAb。将RMFsdAb与HSA D3融合显著改善了其溶解性行为，同时未影响结合能力。重要的是，HSA D3-RMFsdAb在BLI实验和基于细胞的实验中均表现出高度特异性，无法结合在同一HLA亚型上呈递的密切相关p53突变肽。丙氨酸扫描确认了多个肽残基的功能重要性，这些残基与模型预测的表位相互作用一致，突出了该结合的肽中心特性。当以CAR形式表达时，HSA D3-RMFsdAb在存在RMF肽负载的HLA-A*02:01时触发了选择性T细胞激活，而对负载p53(R175H)肽或未加载肽的细胞无反应。这支持了RMFsdAb在工程化T细胞治疗中的潜在应用，并进一步验证了其选择性和特异性。

基于纳米抗体的BiTE相比基于scFv的BiTE显示出一定优势，因为后者由于VL和VH结构域之间可能存在错误配对，以及两个scFv单元之间需要较长的连接子，常常导致双重靶向效果不够理想。同样，基于来源于人抗体可溶性VH支架的RMFsdAb相比传统Fabs能够降低脱靶相互作用的风险，并且其紧凑的模块性允许与其他蛋白质或多价形式进行简单的融合，这一点已在RMFsdAb-HSA D3-RMFsdAb中得到验证。

此前报道的一种针对p53(R175H)/HLA-A*02:01的TCR样抗体，当转化为BiTE形式后，表现出86nM的KD值，并能在小鼠中有效诱导肿瘤细胞杀伤和异种移植瘤的消退。HSA D3-RMFsdAb表现出相当的亲和力（KD为81nM），其二价形式显示出显著增强的靶标结合能力（KD为0.37nM）。鉴于RMF肽来源于在白血病和多种实体瘤中异常表达的致癌蛋白WT1，RMFsdAb为包括双特异性抗体、BiTE以及抗体-药物偶联物（ADCs）在内的多种治疗形式提供了基础工具。

该方法不同于传统的文库筛选或体外进化，而是利用高分辨率结构数据和计算机设计来构建类似TCR的纳米抗体。此外，这里描述的结构特征和设计策略可作为开发针对其他临床相关pMHC靶点的纳米抗体的通用蓝图。总之，这项工作建立了一个以肽为中心、基于计算机设计的平台，用于生成具有高度特异性和类似TCR性质的紧凑且稳定的纳米抗体，从而扩展了可用于靶向MHC I上呈递的细胞内抗原的分子工具库。

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