昆虫系统表达-大分子蛋白/跨膜蛋白表达

重组蛋白的高效表达是现代生物技术、结构生物学以及生物制药产业的核心环节。常见的蛋白表达系统包括原核细菌、大肠杆菌、酵母以及哺乳动物细胞。大肠杆菌表达速度快、成本低，但缺乏复杂的翻译后修饰 (post-translational modifications, PTMs)；酵母能完成部分修饰，但糖基化模式与人类差异较大；哺乳动物细胞系统修饰最接近天然环境，但建立稳定细胞株耗时长，且生产成本较高。相比之下，昆虫细胞表达系统，尤其是基于杆状病毒 (baculovirus) 的表达系统 (Baculovirus Expression Vector System, BEVS)，在表达效率、翻译后修饰和成本之间取得了较好平衡，因此成为表达大分子蛋白和跨膜蛋白的重要平台。

昆虫细胞表达系统概述

1. 常用细胞株

最常见的昆虫细胞包括来源于玉米夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 的 Sf9 和 Sf21，以及来自斜纹夜蛾 (Trichoplusia ni) 的 High Five™ (BTI-Tn-5B1-4) 细胞。Sf9 与 Sf21 常用于杆状病毒扩增与蛋白表达，而 High Five 细胞在表达分泌型蛋白方面具有更高效率，已被广泛应用于疫苗生产。

2. BEVS 系统特点

BEVS 依赖杆状病毒感染昆虫细胞。其优点是：

①．启动子强，表达量高；

②．可表达多亚基复合体与病毒样颗粒 (VLP)；

③．能进行真核特有的 PTMs，如糖基化、磷酸化。

不足之处在于：构建重组病毒流程较复杂，感染后细胞寿命有限，且部分糖基化模式与人类差异明显。

3. 无病毒瞬时表达 (virus-free TGE)

除 BEVS 外，近年来发展出基于质粒瞬时转染的表达策略，即 virus-free transient gene expression (TGE)。该方法不依赖病毒扩增，缩短了生产周期，避免了病毒带来的安全与纯化难题。研究表明，TGE 在膜蛋白和抗体表达方面展现了良好的应用前景。

大分子蛋白表达策略

1. 翻译后修饰能力

昆虫细胞具备诸如磷酸化、N-糖基化、泛素化、乙酰化等 PTMs 能力，虽与哺乳动物系统稍有差异，但通过基因工程改造可接近人类 glycosylation 模式。如利用 Adaptive Laboratory Evolution (ALE) 和其他技术，可增强 PTM 功能与表达产率。

2. VLP 与复杂蛋白表达

BEVS 适合表达 VLP 和多峋复合体，常见策略包括 Bac-to-Bac 系统、多病毒共感染（MultiBac）、稳定细胞株构建等。virus-free 系统也能表达 VLP，如通过共转染多基因质粒并建立稳定细胞株。

3. 提升表达效率的方法

-- 抗凋亡基因（如 P35、vankyrin）用于延长感染后细胞寿命，提高蛋白产量。

-- RNA 干扰沉默促凋亡基因，如 TSC1 或 caspase，可推动表达效率。

-- 改进启动子（如 polh 或 p10）、采用 FACS/qPCR 快速滴度法、有助缩短 BEVS 生产周期。

-- 高密度培养与 ALE 策略也可提升整体产量与稳定性。

跨膜蛋白表达的挑战与解决方案

1. 跨膜蛋白表达难点

跨膜蛋白具有疏水 α-螺旋结构、不稳定且表达水平通常低，不易正确折叠与纯化。BEVS 在感染晚期可能导致细胞膜结构破坏，影响跨膜蛋白表达。

2. 昆虫 TGE的优势

最新研究表明，High Five 细胞通过无病毒瞬时转染结合优化的溶出剂 (如 DDM/CHS) 与纯化标签 (如 Twin-Strep)，能够获得均一性和稳定性更高的膜蛋白。这一方法在成本和效率上均优于哺乳动物系统，特别适合结构生物学研究。

昆虫细胞表达的优化策略与未来发展方向

1. 优化载体设计

-- 采用强启动子或双启动子系统提升表达量；

-- 加入信号肽促进分泌；

-- 融合可切除标签以便纯化。

2. 细胞株工程化

-- 表达人源糖基转移酶，实现类人糖基化；

-- 利用 CRISPR/Cas 编辑凋亡相关基因，提高细胞存活率；

-- 引入伴侣蛋白，增强折叠效率。

3. 工艺优化

-- 高密度悬浮培养结合分批补料；

-- 精准控制溶氧和 pH，减少应激；

-- 应用一次性生物反应器，提升工业化可扩展性。

4. 跨膜蛋白特化方案

-- 表达伴侣蛋白帮助嵌入膜环境；

-- 结合脂质纳米颗粒或纳米抗体稳定膜蛋白结构；

-- 利用改良去垢剂减少蛋白聚集。

5. 未来发展方向

-- 合成生物学赋能，实现模块化和可编程的蛋白生产；

-- 自动化与连续化生产，缩短研发周期；

-- 跨平台组合表达，根据不同蛋白需求选择昆虫、哺乳或细菌系统的最优组合。

实际应用案例

1. 疫苗制备：Nuvaxovid/Covovax（流行的病毒蛋白亚单位疫苗）即基于昆虫 BEVS 平台进行生产，展现了其在临床转化中的实力。

2. 抗体与 SARS-CoV-2 蛋白：virus-free 的 High Five 系统已被用于高产量表达抗体和诊断用 SARS-CoV-2 蛋白，显示低聚集性和高稳定性。

3. 膜蛋白结构研究：昆虫 TGE 系统成了膜蛋白结构解析的替代方案，兼顾分子质量与经济性。

昆虫细胞表达系统，尤其结合 BEVS 和 virus-free TGE，提供了一套灵活、高效而经济的大分子蛋白与跨膜蛋白表达平台。它不仅能满足 PTM 和结构复杂蛋白的需求。未来可通过细胞株工程改造、高密度培养和合成生物技术，进一步提升表达效率与产品质量。研究者应根据目标蛋白特性、时间成本与制备要求，选择最合适的表达方案。