T细胞衔接器(TCE)：在肿瘤学及其他领域的扩展前景

T细胞衔接器（TCEs）是一种经过工程设计的免疫治疗分子，旨在通过连接T细胞与其靶细胞（如肿瘤细胞或受感染的细胞），从而引导人体免疫系统进行攻击，触发强大的细胞毒性反应。在过去10年中，基于TCE的疗法在肿瘤学领域取得了进展，已有多个针对血液系统恶性肿瘤的疗法获得美国FDA批准，并在实体瘤治疗中展现出越来越大的潜力。这里，英国牛津大学团队，详细阐述了TCE的作用机制，重点介绍其激活T细胞、靶向肿瘤抗原以及调节肿瘤微环境的能力。还深入探讨了显示TCE疗效的临床结果，同时也讨论了诸如CRS、抗原异质性和半衰期短等挑战。TCE设计的最新进展包括多特异性结构的引入和条件激活策略，靶点分子的扩展也使得TCE的应用范围延伸至非肿瘤领域，如自身免疫性疾病和传染病。此外， AI的应用也加速了TCE的研发，帮助识别有利的表位相互作用，降低免疫原性风险，并提升整体设计效率。展望未来，这些进展开启了一个新的时代，有望在癌症乃至更广泛的疾病领域重新定义TCE的成功，为更有效、更安全的免疫治疗带来希望。

TCEs的引入是免疫治疗领域的一项重大突破，它提供了一种新的方法来激活T细胞，以靶向摧毁癌细胞。在癌症免疫治疗不断发展的背景下，TCEs带来了一项关键性的创新，利用人体自身的免疫系统来靶向并清除癌细胞。TCEs是一类双特异性抗体，目前正在进行针对多种恶性肿瘤的临床试验。

靶向CD19/CD3的双特异性抗体blinatumomab（贝林妥欧单抗）获批用于B细胞ALL，证明了该技术的临床潜力，并引发了一波研究热潮，旨在将TCE疗法扩展至血液系统恶性肿瘤以外的领域，并进入实体瘤治疗。TCE通常被设计为能够结合癌细胞上的肿瘤相关抗原（TAAs）以及T细胞上的CD3受体，从而形成一种免疫突触，促使定向细胞毒性作用的发生。

该领域经历了从简单的双特异性结构到多特异性构建体的技术快速进步，后者解决了早期TCE的关键局限性。从1+1双特异性结构发展到2+1结构，通过利用结合力增强肿瘤选择性；再进一步发展到1+1+1三特异性设计，可同时靶向多个抗原或提供共刺激信号，这一过程体现了系统性克服治疗挑战的方法。TCE技术的最新进展也扩展了其在实体瘤中的潜在应用。例如，靶向B7-H3（一种与多种癌症不良预后相关的免疫检查点分子）已被证明在TCE或CAR T细胞参与时增强细胞毒性淋巴细胞的抗肿瘤反应。TCE不仅改变了成人癌症的治疗格局，也显著提高了儿童患者的无病生存率（DFS）。在最近的一项III期临床试验中，将blinatumomab单抗添加至标准化疗方案中，显著改善了新诊断B-ALL儿童患者的DFS。这些最新进展有可能确立一种新的标准治疗实践。

LAVA-1207是一种双特异性γ-δ TCE（Gammabody），用于转移性去势抵抗性前列腺癌的开发，体现了TCE设计方面的创新。LAVA-1207靶向Vγ9Vδ2-T细胞的Vδ2链以及前列腺癌细胞上的前列腺特异性膜抗原（PSMA），可诱导有效的T细胞介导的癌细胞裂解，同时保护正常细胞。这种特异性以及较低的CRS风险预期，突出了TCE为患者提供更有效且更安全治疗选择的潜力。

然而，TCEs的治疗价值也存在一定的局限性。其疗效的短暂性、需要持续输注以及CRS风险等问题，凸显出有必要通过创新手段来提升其临床应用价值。但总体而言，这些挑战也普遍存在于其他细胞治疗模式中。近期，该领域的发展主要集中在通过开发半衰期延长的TCEs以及联合治疗方案，来降低毒性的同时增强抗肿瘤效果。

随着该领域不断发展，TCEs将在癌症精准治疗及其他领域发挥日益重要的作用。通过结合先进的工程策略、扩展靶点范围以及利用AI驱动的优化手段，有望开发出新一代TCE，在疗效、安全性及适用范围方面超越肿瘤学领域。这里总结了TCE的现状，从基本作用机制到临床应用和生产考量，并重点介绍了将塑造这一革命性治疗方式未来发展的新兴技术进展。

作用机制及不同TCE形式

1+1结构：双特异性设计的基础

1+1结构指的是具有一个针对TAA的结合臂和一个针对T细胞抗原（通常为CD3）的结合臂的TCE。通过同时结合癌细胞和T细胞，1+1形式的TCE建立起一种伪免疫突触，使T细胞靠近肿瘤细胞，从而激活T细胞并引发定向的细胞毒性反应。在结合后，T细胞释放穿孔素和颗粒酶以杀死肿瘤细胞，并分泌细胞因子以增强免疫反应。1+1形式的一个里程碑式例子是blinatumomab单抗，这是首个获得美国FDA批准的TCE药物，用于治疗难治性B-ALL。值得一提的是，blinatumomab单抗是一种小型的单链TCE（约55kDa），由两个scFv组成，其中一个靶向CD19，另一个靶向CD3，两者通过一个柔性连接肽连接（图1a）。

图1 主要的传统和条件性激活TCE形式。

近期许多1+1型TCE，例如针对CD20阳性淋巴瘤的mosunetuzumab和epcoritamab，以及针对多发性骨髓瘤的teclistamab和talquetamab，均基于包含Fc结构域的IgG骨架构建。该Fc结构域能够通过与FcRn受体的相互作用进入再循环通路，从而显著延长药物在体内的循环时间（图1b），使得给药方式可以采用间歇性给药，而非持续输注。值得注意的是，这些含有Fc结构域的TCE通常经过工程化改造，引入Fc突变或采用IgG4亚型，以阻断其与Fcγ受体和补体的结合，从而防止脱靶的免疫激活作用。尽管这些药物取得了成功，1+1型TCE的疗效在很大程度上仍依赖于癌细胞表面存在单一靶点抗原。已有报道称，在使用靶向CD19的TCE或CAR-T细胞治疗后复发的患者中出现了抗原丢失的现象。

此外，与传统的双价抗体不同，1+1 TCE以单价形式结合靶抗原，从而失去了双重抗原结合带来的亲和力优势。在传统的IgG中，即使亲和力中等的结合，在抗原高密度存在的情况下也可以转化为高亲和力的结合。这种亲和力有助于区分高抗原表达的细胞和低表达的细胞。因此，1+1 TCE的靶向作用通常依赖于高亲和力的结合，但这反而可能通过靶向低抗原表达的细胞而降低特异性。例如，一种抗HER2×CD3 BiTE必须使用极高亲和力的HER2结合剂才能发挥作用，但这有可能识别低表达HER2的正常细胞。因此，1+1 TCE的单价特性在效力与特异性之间形成了权衡。较新的设计，如接下来讨论的2+1形式以及双抗原靶向的三特异性TCE，旨在通过恢复亲和力或需要两个抗原激活来克服这些问题。

2+1结构：利用结合力提高选择性

2+1 TCE结构包含两个针对肿瘤抗原的结合域和一个针对CD3的结合域（图1c）。通过与同一细胞上的两个抗原分子结合，2+1 TCE能够更牢固地结合高抗原密度的细胞，而低抗原密度的细胞则结合较弱，从而降低脱靶效应。"通过结合价数调节亲和力"的方法使得可以使用亲和力较低的肿瘤结合域，这些结合域单独作用时可能无法紧密地结合抗原，但在高表达肿瘤抗原的情况下，多个结合域协同作用可实现较强的结合。因此，2+1 TCE能够更有效地将肿瘤细胞与低水平表达抗原的正常细胞区分开来。这一策略已在一种抗HER2×CD3 TCE中得到验证，该TCE含有两个低亲和力的抗HER2结合域，能够选择性清除HER2过表达的癌细胞，同时不影响HER2生理水平的细胞。

多个2+1结构的TCE已进入临床阶段，其中包括近期获批用于治疗复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤的glofitamab（CD20×CD3）。Glofitamab具有两个靶向CD20的Fab片段和一个靶向CD3的片段，结构为类似IgG的异源二聚体。在一项针对淋巴瘤的III期临床试验中，接受glofitamab联合吉西他滨-奥沙利铂治疗的患者，其总生存期中位数达到25.5个月，而接受利妥昔单抗联合吉西他滨-奥沙利铂治疗的患者总生存期中位数仅为12.9个月。除CD20外，研究人员还在探索2+1结构在其他可能受益于结合力增强的肿瘤抗原上的应用。

在TCE设计中，明确"2+1"与"1+2"术语的含义非常重要。按照惯例，"2+1"或"2:1"表示两个肿瘤结合单元和一个CD3结合单元。相反的"1:2"形式，即一个肿瘤结合单元和两个CD3结合单元，在实际中通常被避免使用，因为双价的CD3结合可能会在没有肿瘤存在的情况下交联或激活T细胞。因此，大多数TCE采用单一的CD3结合臂。"2+1"形式仍然是首选方案，它通过提高对肿瘤细胞的选择性，来利用结合力增强效应，同时不会增加非特异性T细胞交联的风险。

1+1+1三特异性结构：应对复杂性与耐药性

三特异性TCE（1+1+1构型）包含三个不同的结合结构域，能够同时识别三种不同的抗原。在TCE的背景下，其中一种抗原通常是CD3，另外两种则要么是两种不同的肿瘤抗原，要么是一种肿瘤抗原加上一个额外的T细胞共刺激受体。该构型代表了对传统双特异性分子的改进，能够解决多个挑战，例如肿瘤抗原异质性和T细胞激活不足等问题。三特异性TCE的设计主要有两大类：双肿瘤靶向型和共刺激型TCE（图1c）。

双肿瘤靶向三特异性TCE

在这种构型中，TCE靶向两种不同的肿瘤抗原以及CD3。其原理在于增强对异质性肿瘤的识别能力，并防止抗原逃逸。当某个癌细胞丢失其中一种抗原时，它可能仍然表达第二种抗原，从而使TCE可通过剩余的结合臂与之结合并将其杀死。相反，如果某个肿瘤细胞同时表达两种靶抗原，则TCE可以同时与两者结合，从而对该细胞实现更高亲和力的结合。例如，ISB 2001是一种三特异性TCE，可靶向多发性骨髓瘤细胞上的BCMA和CD38，以及CD3。在临床前研究中，即使其中一个抗原（BCMA或CD38）缺失，ISB 2001仍能有效杀死骨髓瘤细胞。当两种抗原均存在时，双重结合可带来更强的肿瘤细胞杀伤效果。另一个双靶向的例子是用于B-ALL的CD19×CD22×CD3 TCE。通过靶向两种不同的B系抗原（CD19和CD22），该TCE在小鼠模型中延缓了抗原丢失导致的复发，并改善了整体白血病清除效果。这些研究结果表明，1+1+1双靶向TCE能够应对肿瘤异质性，并降低免疫逃逸的可能性。

共刺激三特异性TCE

三特异性TCE的第二大主要类别涉及靶向另一个TCR，通常是共刺激分子，同时靶向CD3和肿瘤抗原。这种设计直接解决了T细胞完全激活、增殖和持续杀伤功能所需的两个信号问题，即不仅需要TCR信号（"信号1"），还需要共刺激信号（"信号2"，例如通过CD28）。在肿瘤中，尤其是在具有免疫抑制环境的实体瘤中，T细胞可能无法获得足够的共刺激，从而导致T细胞耗竭或无能。带有共刺激结构域的三特异性TCE可以提供缺失的第二个信号，其中CD28是最常见的选择之一。一个例子是靶向CD3、CD28和PSMA的TCE，用于前列腺癌治疗。与CD3xPSMA TCE相比，这种三特异性TCE可引发更强的T细胞激活、细胞因子产生（如IL-2和TNF-α）以及效应记忆T细胞的形成。除了CD28，还可以靶向其他共刺激或免疫调节受体。例如，当靶向共刺激结构域4-1BB时，也观察到了与靶向CD28类似的免疫反应增强。有趣的是，当靶向OX40时，TCE促进了CD4+中央记忆T细胞的扩增，并减少了Treg细胞的诱导，这凸显了所选共刺激分子的重要性。尽管共刺激型三特异性抗体仍处于早期临床试验阶段，但它们代表了一种有前景的策略，可提高T细胞的效能和持久性，从而在T细胞常处于免疫抑制状态的实体瘤治疗中取得更好的疗效。

TCEs通过HLA呈递靶向细胞内抗原/扩展靶抗原范围

传统TCE靶向肿瘤细胞表面的抗原。然而，许多肿瘤特异性抗原（如癌蛋白和病毒抗原）是胞内蛋白，传统TCE无法作用于这些抗原。为了使T细胞重新靶向胞内抗原，较新的TCE方式采用了可识别p-HLA复合物的结合结构域（图1d）。本质上，它们结合了TCR的特异性与TCE对CD3的激活原理。

一个很好的例子是Tebentafusp，这是首个基于TCR的双特异性TCE，已获批用于治疗葡萄膜黑色素瘤。它包含一个高亲和力的TCR，特异性识别由HLA-A02:01呈递的gp100黑色素瘤抗原肽，并与抗CD3 scFv融合。该分子仅在黑色素瘤细胞通过HLA-A2分子呈递gp100肽时才能结合。在针对转移性葡萄膜黑色素瘤的随机试验中，Tebentafusp将中位总生存期显著延长至21.6个月，而对照组（帕博利珠单抗、伊匹木单抗或达卡巴嗪）为16.9个月，从而验证了靶向p-HLA复合物的方法。

除了Tebentafusp外，还有多种TCR-mimic TCE正在研发中。这些药物使用经过改造的人源TCR或抗体片段，能够识别特定的p-HLA复合物。例如，一种靶向细胞内癌基因WT1的双特异性TCE是通过一种类似TCR的抗体开发而成，该抗体可结合WT1肽/HLA-A02:01复合物。同样，研究人员也发现了针对突变型新抗原如KRAS G12D的高亲和力可溶性TCR，这种突变常见于胰腺癌和结直肠癌。一项研究描述了一种基于TCR的细胞药物，该药物靶向由HLA-A11:01呈递的KRAS G12D肽，显示出T细胞对KRAS突变肿瘤细胞的强效杀伤能力。针对p53热点突变R175H的研究也在进行中。最近的一份报告介绍了一种TCE，其可结合p53 R175H肽的HLA-A*02:01复合物以及CD3，从而在体外选择性溶解p53突变的肿瘤细胞。这些例子表明，TCE技术正在不断扩大可靶向的细胞内靶点范围。

靶向p-HLA复合物的主要局限性在于HLA限制性。人类群体的HLA类型具有多样性，因此由某一等位基因（如HLA-A*02:01）呈递的肽段，在缺乏该等位基因的另一名患者中可能无法呈递。这意味着这类TCE需要以等位基因特异性的方式进行开发。尽管如此，这一策略大大扩展了可靶向的癌症抗原范围，包括此前抗体难以靶向的癌基因、抑癌基因、癌-睾抗原以及病毒诱导型癌症中的病毒抗原。

克服关键治疗挑战

细胞因子释放综合征（CRS）：机制与缓解

CRS是一种急性毒性反应，由T细胞和其他免疫细胞迅速大量释放炎性细胞因子所致。在临床上，CRS表现为发热、低血压、心动过速，在严重情况下可能进展为毛细血管渗漏和多器官功能障碍。在接受TCE治疗的患者中，被激活的T细胞会分泌IFNγ、TNFα以及白介素如IL-2、IL-6，从而触发全身性的炎症级联反应。单核细胞和巨噬细胞通常在继发激活后（例如受到T细胞释放的IFNγ刺激）成为导致多数CRS症状的主要IL-6和IL-1的重要来源。CRS的发生率随不同的TCE而异。例如，blinatumomab单抗的研究显示，约11-15%的患者出现CRS，其中2-5%为严重（3级及以上）CRS。从作用机制上讲，只要存在靶抗原，TCE可以多克隆地激活任何T细胞，而不论其原有的抗原特异性如何，从而导致大量T细胞释放细胞因子。

据观察，T细胞杀伤作用可以在CD3/TCR结合强度相对较低的情况下发生，而强烈的细胞因子分泌（以及完全的T细胞激活）则需要更高的抗原强度。换句话说，T细胞激活似乎存在双重阈值：一个用于细胞毒性作用，另一个更高的阈值用于细胞因子释放。能够强烈激活CD3的TCE可使T细胞突破这两个阈值，从而引发靶细胞裂解和大量细胞因子产生。这些细胞因子，尤其是IL-6，随后介导了CRS的全身症状。

为减轻CRS，已采用多种策略。在临床上，常用的一种方法是递增剂量法，即患者首先接受非常低的TCE首剂，随后几天逐渐增加剂量，让免疫系统适应。低剂量的初始T细胞激活可能会引起一些细胞因子释放和T细胞扩增。然而，由于剂量较低，CRS症状较轻，使免疫系统逐步被激活，从而避免早期失控的炎症反应。这种方法显著降低了与TCE治疗相关的CRS发生率和严重程度。预防性或早期使用免疫抑制药物是另一种策略。例如，在出现CRS的最初迹象时给予皮质类固醇或IL-6受体阻滞剂（托珠单抗），可以最大程度地减少严重不良事件的发生概率。

在药物设计方面，降低CRS风险而不影响抗肿瘤活性的一个主要方法是调节CD3结合域的亲和力。通过降低亲和力，双特异性抗体（TCE）诱导的T细胞激活信号会变得不那么强烈，从而保持在细胞因子释放的阈值之下，但仍能触发细胞毒性。临床前研究表明，降低CD3亲和力可以将细胞毒效力与细胞因子分泌分离开来，T细胞仍然能够高效地杀死靶细胞，但产生的IL-2和IL-6显著减少。

药代动力学与半衰期延长策略

早期TCE疗法面临的另一个挑战是其较短的血浆半衰期。缺乏Fc结构域的TCE会迅速经肾小球滤过清除，且缺乏在体内循环利用的机制。例如，blinatumomab单抗的半衰期约为2小时，因此需要在6周疗程中的4周进行持续静脉输注。这种给药方式对患者和医疗系统而言在实施上较为不便。因此，在分子设计中延长TCE的半衰期已成为重点，以便在保持药物持续暴露的同时实现更为便捷的给药方案。

延长半衰期的主要策略一直是将一个Fc结构域整合到TCE构建体中。Fc区域通过增大分子尺寸以减少肾脏清除，并通过与新生Fc受体（FcRn）结合，从而避免抗体降解，使其半衰期达到5-7天，允许每星期或每两周给药一次。大多数Fc结构域经过工程改造，使其"沉默"，以阻止与Fcγ受体或补体通路发生任何相互作用。

另一种延长半衰期的方法是通过白蛋白结合。人血清白蛋白是一种丰富的血清蛋白，分子量约为67 kDa，由于受到FcRn介导的循环作用，其半衰期较长，约为20天，这一点与IgG类似。通过在一个TCE上连接一个白蛋白结合结构域，药物便可以结合白蛋白并经历FcRn循环。已有研究使用抗白蛋白单结构域抗体构建了TCE，形成一种单链蛋白。尽管这种三特异性TCE的分子量相对较小（约53 kDa），但其白蛋白结合特性使其具有较长的血清半衰期（可达数天）。

调节TCE在体内循环时间的更精细方法是改变Fc或白蛋白结合结构域与FcRn的结合亲和力。通过增强FcRn的结合能力，可以进一步延长TCE的半衰期。相反，如果出于安全考虑不希望产生过长的暴露时间，则可略微降低FcRn的结合能力以缩短半衰期。据报道，通过调节与FcRn的相互作用，双特异性TCE-白蛋白融合蛋白在小鼠中实现了"可编程"的半衰期，范围从约19小时到约37小时，相比之下，未与白蛋白融合的TCE半衰期仅为0.6小时。

通过条件激活来减少off-tumor效应

TCE疗法的一个重大担忧是on-target off-tumor毒性。与主要局限于B系细胞或浆细胞的血液系统抗原（如CD19或BCMA）不同，实体肿瘤抗原常常与某些健康组织共享。当TCE引导T细胞攻击任何表达目标抗原的细胞时，如果正常细胞和癌细胞都表达相同的抗原，TCE本身无法区分两者，从而可能导致严重的off-tumor毒性。为了解决这一问题，研究人员设计了条件性激活的TCE，它们在正常组织中保持非活性状态，仅在肿瘤微环境中才被激活。这些TCE类似于前药，需要肿瘤特异性的触发机制来释放其激活T细胞的能力。目前已有多种策略被开发出来：

蛋白酶激活的TCEs

肿瘤相关蛋白酶是在TME中大量表达的酶类，通常被用作激活触发因素。TCE通过包含蛋白酶切割位点的连接子，将覆盖关键结合域（通常是抗CD3臂）的屏蔽肽连接起来（图1e）。在血液循环和正常组织中，这种屏蔽肽通过空间位阻阻止CD3结合位点与T细胞的结合，从而防止TCE激活T细胞。然而，在TME中，基质金属蛋白酶等蛋白酶含量较高，能够切割连接子，使屏蔽肽脱落，暴露出CD3结合域，从而激活肿瘤浸润性T细胞。这种策略的一个显著例子是目前正在进行I期临床试验的靶向EGFRxCD3的屏蔽型TCE药物，用于治疗表达EGFR的实体瘤。根据利用TME生化差异的原理，科研人员还正在开发针对其他肿瘤靶点（如B7-H3）的蛋白酶激活型TCE药物，以实现在肿瘤部位激活药物的效果。

pH敏感型TCEs

TME的另一个显著特征是酸中毒，因为快速生长的肿瘤通常灌注不良，并依赖无氧糖酵解，从而导致乳酸积累，细胞外pH值可低至6.7-7.1（正常组织约为7.4）。pH敏感型TCE被设计成仅在酸性pH条件下结合其靶点，而在生理pH条件下则不结合（图1f）。一种创新技术涉及构建抗体突变体文库，以筛选出在低pH条件下具有条件性结合能力的变体。在中性pH条件下，所选变体会被生理化学物质如碳酸氢盐或硫化氢结合，从而有效地被这些化学"塞子"封闭。当TCE扩散至酸性肿瘤组织时，过量的氢离子会使阻断性化学物质发生质子化并从结合位点解离，从而使TCE能够自由地结合靶抗原和CD3。最近一项研究应用该原理开发了一种pH条件性抗EpCAM×CD3双特异性抗体。该TCE在pH7.4时对EpCAM的结合极少，但在pH 6.0时表现出强效结合，从而在酸性pH环境下引发更显著的杀伤作用。这种方法目前仍处于临床前或早期研发阶段，但有望提高TCE治疗的肿瘤特异性。

分体式TCE系统

尽管尚未进入临床应用，但一些研究团队已经提出将TCE分成两个部分，只有当这两个部分结合在一起时才能发挥活性。例如，其中一半的双特异性分子可以包含肿瘤结合域以及抗CD3臂的可变重链（VH），而另一半则包含另一个肿瘤结合臂以及相同抗CD3臂的可变轻链（VL）（图1g）。单独的每一半都是无活性的，无法将T细胞与癌细胞连接起来。如果两个部分都结合到癌细胞上，它们的CD3结构域中的VH和VL就会形成异源二聚体，从而重建出用于招募T细胞的功能性CD3结合域。

生产方法与制造挑战

由于TCE的双特异性和非传统的抗体结构，在制造过程中面临重大挑战。关键考虑因素包括实现多个抗体链的正确配对、保持蛋白质纯度，以及获得足够的产量以满足临床应用需求。

在复杂结构中确保正确的链组装

在制备类似IgG的TCE时，一个核心挑战在于它们通常包含来自两种不同抗体的四条多肽链（两条重链和两条轻链）。如果将这些链共同表达，可能会产生多种可能的配对组合，进而导致重链-重链同源二聚体或重链-轻链错误配对的产生。为了解决这一问题，人们已经开发出了多种工程技术策略。

Knob-into-Hole（KiH）突变：

这是一种基因工程技术，可促进两条不同的重链形成异源二聚体。其中一条重链的CH3区域被突变，形成一个庞大且疏水的"凸出"结构，而另一条重链的CH3区域则被突变形成一个互补的"凹陷"结构。当两者共同表达时，带有凸出结构的重链更倾向于与带有凹陷结构的重链配对，而不是与自身配对，从而促进所需的异源二聚体和双特异性结构的形成。

CrossMab技术：

Knob-into-hole方法可固定重链与重链的配对，但本身并不能确保每条重链都能与其正确的轻链配对。CrossMab方法通过在一个Fab臂的重链与轻链之间交换结构域来解决这一问题。例如，其中一种方法是将某条抗体的VH和CH1结构域与其对应的轻链结构域（VL和CL）互换。通过这种方式，轻链只能与具有互补交换结构域的重链正确配对。

通用轻链：

另一种策略是设计双特异性抗体的两个不同抗原结合Fabs，使其共享相同的轻链序列。采用通用轻链后，特定的重链不会再有轻链错配的问题。通过KiH技术可以强制形成重链-重链异源二聚体。

Fab臂交换（FAE）：

通过控制Fab臂交换在抗体产生后进行体外组装是另一种可能的策略。该方法中，将两种亲本IgG抗体在可暂时还原二硫键以促进半分子交换的条件下混合，并且通过CH3区的突变进一步增强配对过程。

表达平台的选择与优化

目前大多数临床TCE是在哺乳动物细胞系统（主要是中国仓鼠卵巢细胞，CHO细胞）中生产的，因为这些系统能够提供正确的蛋白质折叠、组装以及翻译后修饰。同时，在早期研发阶段，通常采用HEK293或CHO细胞的瞬时转染技术，以快速生产TCE候选分子。

对于某些较小的TCE结构形式，特别是仅由连接片段组成的格式，微生物表达系统（如大肠杆菌）可以实现重组蛋白的高效表达（每升数克）。然而，在大肠杆菌中表达的蛋白质通常会以不溶性聚集体的形式积累在包涵体中。这需要额外的变性和体外复性步骤以获得具有功能的产物。

其他宿主如酵母也已被研究。酵母作为真核生物，能够进行翻译后修饰，并且通常能分泌折叠正确的蛋白质，同时其生长速度也快于大多数哺乳动物细胞。此外，无细胞表达系统也是一种新兴的方法。虽然无细胞生产具有速度快和控制精确的优势，但目前成本较高且存在可扩展性方面的限制。哺乳动物细胞表达仍然是商业TCE生产的主流方法。

临床现状与已获批的TCE

First-generation成功

首个获批的TCE是catumaxomab（卡妥索单抗），它可结合EpCAM阳性肿瘤细胞和T细胞，诱导T细胞介导的癌细胞杀伤作用。卡妥索单抗属于第一代TCE，具有完整的Fc区域，该区域可结合在巨噬细胞和NK细胞上的FcRs。首次尝试静脉给药失败，因为严重的肝脏毒性反应，这种毒性与Fc介导的非靶向性库普弗细胞(Kupffer cell)和T细胞在肝脏的激活有关。随后于2009年在欧盟获批用于治疗EpCAM阳性癌性腹水患者的腹腔注射治疗，但由于非特异性T细胞激活引起的CRS，静脉注射耐受性不佳。因此，卡妥索单抗于2013年被FDA撤市，后于2017年因商业原因被EMA撤市。下一代TCE设计包括惰性的恒定区域，旨在减少Fc介导的T细胞毒性，同时增强淋巴细胞迁移能力和抗肿瘤效力。此后一段时间，直到2014年，贝林妥欧单抗被加速批准用于前体B细胞ALL的治疗。

CD19/CD3 BiTE--blinatumomab单抗已在治疗B细胞恶性肿瘤方面明确验证了TCEs的抗肿瘤活性和临床疗效概念。其已被证实的临床疗效和良好的安全性使其成为首个获得EMA和FDA批准用于治疗复发或难治性费城染色体（Ph）阴性前体B-ALL儿童及成人患者的同类药物。

目前，FDA批准的TCEs可用于治疗某些血液系统恶性肿瘤，包括多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤，以及非小细胞肺癌和黑色素瘤。近期获得FDA批准的TCEs还包括glofitamab（CD20×CD3）、mosunetuzumab（CD20×CD3）、teclistamab（BCMA×CD3）以及talquetamab（GPRC5D×CD3），表明TCEs的应用范围正在不断扩大，涵盖血液系统恶性肿瘤和实体瘤（表1）。

表1 癌症治疗批准的TCEs

靶标谱和新靶点

TCE通常以细胞外蛋白为靶点，其理想靶标应在肿瘤细胞表面表达，而在健康细胞上不表达，以避免on-target off-tumor毒性。由于靶抗原丢失和下调是癌症免疫逃逸的最常见机制之一，因此所选择的靶抗原还应对肿瘤细胞存活具有重要作用。

快速的靶点内化可能会对TCE的活性产生负面影响，因为这会限制免疫突触的形成，只有细胞表面结合的TCE才能形成免疫突触。新的TCE形式已被开发出来，用于检测由HLA分子呈现在细胞表面的来自细胞内蛋白的肽段。这些形式尤其具有价值，因为大多数TAAs都来源于细胞内蛋白。通过系统性地分析癌细胞表面呈现的蛋白，可以识别出新的TAAs。这些新的TCE形式可靶向多种异常表达的细胞内致癌抗原、TAAs、突变的癌基因以及抑癌基因。

开发有效的TCE的关键方面在于靶点的精心选择。CD19和CD20是B细胞上广泛表达的相对稳定的细胞表面抗原。因此，目前正在进行的临床试验中，大多数靶向表面抗原包括CD19、CD20以及BCMA（B细胞成熟抗原）（表2，图2）。针对如PSMA、EpCAM、CEA（癌胚抗原）以及GPC3等实体瘤抗原的TCE的发展标志着该技术在血液系统恶性肿瘤之外领域的重大拓展。这些BiTE被设计用于应对实体瘤所带来的独特挑战，这些挑战包括相较于血液系统肿瘤更为复杂和具有免疫抑制性的肿瘤微环境（图2）。

表2 不止于肿瘤学

图2 TCE在癌症治疗临床开发中的靶点特征。目前有超过200种TCE抗体正在进行临床试验。大约一半的双特异性抗体以CD20、CD19和BCMA为靶点。不过，一些新的靶点也已进入早期临床试验阶段。

肿瘤学以外的应用

尽管血液系统恶性肿瘤一直是双特异性TCE的主要成功领域，但新的设计旨在克服实体瘤中的免疫抑制性TME。例如，靶向前列腺癌中PSMA和非小细胞肺癌中EGFR的TCE。创新技术如掩蔽-去掩蔽平台或pH依赖性结合技术，旨在提高肿瘤特异性并减少全身毒性。

TCE主要在肿瘤学领域开发和应用，尤其是针对血液系统恶性肿瘤和实体瘤。然而，人们对其在非肿瘤适应症（如自身免疫性疾病和感染性疾病）中的应用也日益关注并展现出潜力。一些靶点，例如CD38，在肿瘤和非肿瘤（全身性自身免疫性疾病）领域均可能具有应用价值。CD38是一种多功能跨膜糖蛋白，在癌症和全身性自身免疫性疾病中均发挥重要作用。它在多种肿瘤类型中高度表达，包括多发性骨髓瘤、白血病和实体瘤。其过度表达与癌症进展、血管生成和免疫抑制有关，使其成为有前景的治疗靶点。针对CD38的单克隆抗体如达雷妥尤单抗（Daratumumab）和伊沙妥昔单抗（Isatuximab）在治疗多发性骨髓瘤方面已取得显著成效，并正在探索用于其他恶性肿瘤的治疗。

在系统性自身免疫性疾病中，CD38表达于多种免疫细胞上，其中包括负责产生自身抗体的浆细胞。以达雷妥尤单抗等单克隆抗体靶向CD38已成为治疗系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎等自身免疫性疾病的一种有前景的治疗策略。通过清除产生自身抗体的浆细胞并调节免疫细胞的功能，抗CD38治疗有望降低疾病活动度并防止这些严重疾病的发生发展。CD38在肿瘤学和免疫学中的双重作用突显了其作为多个疾病领域治疗靶点的重要性。

未来方向与技术创新

TCE设计中的人工智能。AI作为加速药物设计的重要工具，尤其是在TCE等复杂结构的设计中，开启了一个新的时代。AI驱动的方法可以分析大量抗体、TCR和肿瘤抗原的数据集，以优化结合特异性、降低免疫原性并最大程度减少脱靶效应。

通过整合由AI驱动的结构预测（AlphaFold 和 Rosetta）、生成式设计以及基于物理的模拟技术，生物技术公司正在以前所未有的速度和精度推进双特异性TCE的开发。随着这些计算平台的持续进步，将会有更多针对癌症和非肿瘤适应症的特定TCE出现，从而解决免疫治疗中关于毒性、疗效和可扩展性的核心挑战。目前的项目还包括利用机器学习驱动的方法优化TCE，用于治疗晚期癌症，推动具有更好疗效和安全性的候选药物进入下一阶段的开发。LabGenius展示了机器学习如何系统地优化TCE设计中的多个属性（例如选择性、效力和可开发性）。其基于机器学习的平台开发出的HER2×CD3抗体，在肿瘤选择性杀伤能力方面相较临床参照标准提升了超过400倍。

总结

TCE已从早期的双特异性抗体迅速发展为能够靶向多个肿瘤抗原或共刺激通路的多特异性结构。它们在血液系统恶性肿瘤中的成功以及在实体瘤中的初步前景，展示了基于TCE的免疫治疗的巨大潜力。目前的研究重点在于优化抗原选择性、延长半衰期、减少CRS以及降低off-tumor毒性。此外，人们对TCE在非肿瘤领域的应用也日益感兴趣，正在探索其在自身免疫性疾病和感染性疾病中发挥TCE介导的细胞毒性作用。随着新一代TCE形式及联合治疗策略的不断出现，TCE正处于重塑癌症免疫治疗领域的前沿，有望提供更为精准、高效且安全的免疫治疗方案。

双特异性TCE通过引导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，彻底改变了免疫治疗领域，已在血液系统恶性肿瘤中取得显著的临床疗效，并在实体瘤治疗中展现出良好的应用前景。随着TCE设计的不断进步，包括1+1、2+1和1+1+1等结构形式的出现，提高了靶向结合能力，应对了肿瘤抗原异质性问题，并改善了安全性特征。新一代TCE正通过基于TCR的机制靶向胞内抗原，并且其应用范围也正从肿瘤领域拓展至自身免疫性疾病及其他疾病适应症。针对CRS、半衰期短以及脱靶毒性等挑战，研究人员正通过创新的工程化策略加以缓解，而AI驱动的方法则为精细优化TCE结构提供了新的机遇。随着TCE研发的不断推进，其在联合治疗方案中的成功整合很可能将推动下一波重大突破的出现。

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