EAE造模解决方案

实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE）是研究多发性硬化（MS）的金标准动物模型，通过模拟自身免疫性T细胞攻击中枢神经系统（CNS），再现MS的神经炎症、脱髓鞘及神经功能障碍等核心病理特征。EAE模型在MS发病机制研究、神经免疫调节药物筛选（如Roflumilast）、髓鞘修复与神经保护疗法开发等研究领域应用广泛。

1. EAE模型核心试剂

（1）免疫原（抗原）

MOG₃₅₋₅₅（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55肽段）

来源：人工合成肽，模拟MS中的自身抗原

浓度：通常使用 150-300 μg/只小鼠（溶于PBS、生理盐水或CFA中）

（2）佐剂

完全弗氏佐剂（CFA, Complete Freund's Adjuvant）

成分：矿物油 + 灭活结核分枝杆菌（如 Mycobacterium tuberculosis H37Ra，浓度 4-5 mg/mL）

作用：增强免疫应答，与MOG₃₅₋₅₅乳化后使用

（3）免疫增强剂

百日咳毒素（Pertussis Toxin, PTX）

剂量： 200-500 ng/只小鼠（腹腔注射）

注射时间：免疫当天（Day 0）及第2天（Day 2）

作用：破坏血脑屏障，促进T细胞浸润中枢神经系统

2. EAE模型诱导方法

（1）实验准备

实验动物：通常选择6 - 8周龄的雌性C57BL/6小鼠或Sprague-Dawley大鼠。

动物数量：根据实验设计，每组至少需要10只动物以确保统计学意义。

动物适应：将动物在实验环境中适应1周，保持温度、湿度和光照条件稳定。

试剂准备：将MOG35-55肽溶解于生理盐水中，与等体积的CFA混合乳化，形成均匀的乳剂。

（2）EAE诱导

第0天：

乳剂制备：将300 µg MOG35-55肽与300 µL CFA混合乳化。

注射：将乳剂分两次（每侧100 µL）皮下注射于小鼠双侧腋窝、腹股沟和背部。

PTX注射：腹腔注射200 ng PTX。

第2天：

再次注射PTX：腹腔注射200 ng PTX。

3. EAE模型验证

EAE模型的验证需通过临床评估、行为学、组织病理学、分子生物学等多维度进行，以下是系统的验证方法分类及操作要点。

（1）临床评分验证

①标准化评分系统0-5分量表（最常用）：从第0天开始，连续观察30天或更长时间。

评分标准：0分：无症状。1分：尾部无力或瘫痪。2分：后肢无力。3分：后肢瘫痪。4分：四肢瘫痪。5分：死亡。

②体重监测：EAE小鼠通常伴随体重下降（>10%提示模型成功），需每日记录，体重持续下降可能需伦理干预。

（2）行为学检测

①运动功能评估

转棒实验（Rotarod）：加速模式（4-40 rpm，5min内完成）记录跌落时间，反映协调性与耐力。

步态分析（CatWalk或足印法）：量化步幅长度、基宽、摆动速度。

②抑郁样行为检测

强迫游泳实验（FST）：记录不动时间（反映绝望行为）。

悬尾实验（TST）：辅助验证抑郁表型。

（3）组织病理学验证

①取材与处理

灌注固定：4%多聚甲醛灌注后取脊髓（腰膨大段）和脑组织。

切片制备：石蜡切片（5μm）或冷冻切片（10μm）。

②染色方法

（4）分子生物学验证

①流式细胞术

细胞亚群分析：Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）、Treg（CD4+FoxP3+）。

样本来源：脾脏、淋巴结、中枢神经系统单细胞悬液。

②细胞因子检测

ELISA/液相芯片：促炎因子：TNF-α、IL-6、IL-17

抗炎因子：IL-10、TGF-β

qPCR：脊髓/脑组织中细胞因子mRNA表达。

③蛋白表达分析

Western Blot：

炎症通路蛋白：NF-κB p65、pSTAT3

神经保护标志物：BDNF、NGF

4. 模型成功标准

基础标准：发病率>80%（临床评分≥2）；病理确认HE显示炎性浸润+ LFB证实髓鞘脱失。

高级标准：行为学异常（Rotarod时间↓50%）；分子标志物：Th17比例↑2倍，CNS中IL-17水平显著升高。

5. 常见问题与解决方案

6. 特色应用案例

东南大学医学院神经精神病学研究所附属中大医院神经内科张志珺教授团队采用实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型，研究Roflumilast的作用。他们的研究表明Roflumilast有可能成为改善MS抑郁症状和急性时相运动障碍的潜在药物，其抗炎、减炎和抑制小胶质细胞激活的特性提示其在MS治疗中的潜力。IL6、IL1B和TNF是MS和抑郁症共有的关键基因，其编码的细胞因子存在蛋白质相互作用。IL-6可能在多发性硬化症相关抑郁中发挥重要作用，IL-6拮抗剂可能成为改善多发性硬化症抑郁的潜在治疗策略。研究结果为进一步阐明MS和抑郁症的发病机制提供了重要线索[1]。

参考文献：

[1] Wang Z, Zhang Y, Chai J, Wu Y, Zhang W, Zhang Z. Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor function and depressive symptoms in multiple sclerosis[J]. J Affect Disord. 2024;350:761-773. doi:10.1016/j.jad.2023.12.074