以药找靶 | LIP-MS破解天然化合物抗癌靶点

文献：Phytomedicine

口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部常见恶性肿瘤，五年生存率低于50%，现有治疗手段效果有限。自噬（Autophagy） 在OSCC进展中起关键作用，抑制自噬可能成为新的治疗策略。Sanguinarine（Sang） 是一种天然生物碱，具有抗炎和抗癌活性，但其对OSCC的作用机制尚不明确。

近期，发表于植物药学和药物化学学科下的一区期刊《Phytomedicine》（IF=8.3）的文章，不仅揭示了Sang通过抑制自噬流阻滞OSCC进展的全新机制，更关键的是，该研究成功运用了有限蛋白酶解偶联质谱技术（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry, LiP-MS），精准锁定了Sang在细胞内的直接作用靶点--丙酮酸激酶M2 (PKM2)，为理解其抗癌机制奠定了坚实的分子基础。

研究亮点与LiP-MS的核心作用

文章中选择口腔鳞癌（OSCC）作为想要研究的癌症疾病，通过前期文献发现NUPR1/TFE3通路通过自噬保护OSCC细胞，因此推测抑制自噬可成为OSCC的新的治疗思路。

表型发现

文章从药物库中筛选出一个名为Sanguinarine（Sang）的化合物对OSCC细胞系增殖有抑制效果，通过Western Blot检测、免疫荧光、RFP-GFP-LC3B 探针、LysoSensor探针等实验初步确定其通过破坏溶酶体功能（降低LAMP1/2表达、改变溶酶体pH）阻断自噬流，最终导致癌细胞死亡。

锁定靶点

明确表型后，最关键的问题随之而来：Sang如何在细胞内发挥作用？其直接结合的靶点蛋白是什么？

LIP-MS技术破局：

为了解决这个问题，研究团队使用LiP-MS技术这一前沿化学生物学工具。什么是LIP-MS技术？

LIP-MS是一种通过研究小分子化合物与蛋白质相互作用，进行药物靶点筛选的技术。小分子药物与细胞裂解物共同孵育，随后进行有限酶切。由于小分子化合物与蛋白质的结合可能引起蛋白质构象的变化，会在酶解过程中产生包含与小分子化合物结合的靶蛋白的特异性片段。通过使用定量质谱比较小分子处理样品与未处理样品中肽段的丰度差异，可以精确识别出与小分子药物结合的蛋白质及其作用位点。

锁定关键靶点PKM2：

为此，研究团队使用了限制性蛋白质组学（LiP-MS）作为实验手段，并成功找到6个可能的靶点蛋白。之后结合GalaxySagittarius 算法的预测结果，发现PKM2是6个蛋白之中唯一一个预测结果中排名靠前的蛋白。

之后，研究团队使用SPR（表面等离子共振）和MST（微量热泳动）进一步证实Sang与PKM2的结合力良好，解离常数Kd = 2.63 ± 0.31 μM，证实PKM2确实是Sang的靶蛋白。

结合机制深度解析：

找到Sang在OSCC细胞中作用的靶蛋白之后，研究团队检测了Sang处理之后的OSCC细胞中的PKM2表达水平，发现表达量没有变化。这带来了新的疑问，Sang是如何影响细胞内的PKM2蛋白的呢？酶活实验结果证明，Sang没有使PKM2的表达量下降，而是直接降低PKM2的酶活性。

研究者继续对Sang的作用机制进行挖掘，使用"分子对接 + 动力学模拟"结合的方式，找到了位于药物结合口袋1的F26氨基酸贡献了最大的结合能量。将PKM2中的F26氨基酸突变掉，Sang立刻失去了对蛋白的酶活抑制作用。之后研究团队通过在小鼠异种移植模型上进行体内实验，再一次验证了这个结果。

该篇文章通过层层递进的实验逻辑首次揭示了Sang通过PKM2/TFEB轴抑制溶酶体功能，阻断自噬通量，从而抑制OSCC进展。Sang作为天然化合物，有望成为OSCC治疗的新选择，尤其适用于耐药或副作用敏感患者。

LiP-MS：药物靶点发现的强大手段

该项研究是LiP-MS技术在天然产物靶点鉴定中成功应用的典范。它清晰地展示了LiP-MS作为新一代筛选技术的优势：

原位分析：直接分析Sang处理后的细胞裂解液，在接近天然的生理环境中直接获取蛋白和小分子的相互作用。

无需探针设计与化学修饰：直接使用天然形态的Sang进行研究，无需对小分子进行改构。

结果简单直接：结合生信分析，快速把Sang在OSCC内的可能结合蛋白缩小至6个。

机制分析： 结果直接定位到了Sang和PKM2的结合位置肽段，间接揭示了潜在的结合位点区域，为后续的分子对接、位点突变等精细研究指明了方向。

应用领域

• 小分子药物潜在靶点筛选

• 药物-蛋白结合域分析

• 药物机制研究

• 老药新用